HC2联合细胞块P16技术在液基细胞诊断中的应用

鲁 波，包 磊，李美平，沈 寅，任丽芳，张 鹏

(绍兴市妇幼保健院，浙江 绍兴 312000)

HC2联合细胞块P16技术在液基细胞诊断中的应用

鲁 波，包 磊，李美平，沈 寅，任丽芳，张 鹏

(绍兴市妇幼保健院，浙江 绍兴 312000)

目的 探讨细胞块免疫组化p16染色联合二代杂交捕获技术检测高危型人乳头瘤病毒在宫颈液基细胞学诊断中的应用价值。方法 选取2015年1月至2016年11月在绍兴市妇幼保健院宫颈液基细胞学初检判读为上皮内病变细胞(NILM)后，取TCT剩余保存液制细胞块行免疫组化p16染色，同时行二代杂交捕获检测的患者156例。结果 156例宫颈TCT初检判读为NILM的患者，HC2检测均为阳性；运用细胞块免疫组化P16检测并复查TCT，宫颈高级别鳞状上皮内病变的检出率为19.23%(30/156)。结论 TCT联合运用HC2和细胞块P16技术可以有效地提高宫颈癌及癌前病变筛查的准确性，减少漏诊率。

细胞块；p16蛋白；液基细胞学；第二代杂交捕获技术

宫颈癌是一种发病率仅次于乳腺癌的妇科第二大恶性肿瘤，近年来在全球范围内其发病率呈逐年上升趋势且年龄越来越年轻化[1]。得益于液基细胞学技术的推广，宫颈癌的发病率和死亡率有所下降，但由于受到标本现状、制片水平、阅片经验的限制，薄层液基细胞学检查(thinprep cytologic test，TCT)会存在一定的漏诊率，因此需更加客观的辅助方法帮助其提高敏感性和特异性[2]。本文通过第二代杂交捕获技术(hybrid capture Ⅱ，HC2)联合细胞块P16进行免疫组化技术取得了较好的效果，现介绍如下。

1材料与方法

1.1材料

收集2015年1月至2016年11月绍兴市妇幼保健院行宫颈液基细胞学检查诊断为未见上皮内病变细胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)，HC2阳性共计156例。

1.2方法

1.2.1细胞学检查

宫颈液基细胞学采用美国Cytic公司的Thingpath 2000技术，巴氏染色。细胞学诊断以宫颈/阴道细胞学诊断报告方式(the bethesda system，TBS)(2001)诊断报告模式为标准。

1.2.2细胞块制备

将TCT残液倒入10mL玻璃试管，以2 000r/min离心5min后弃上清液，加入2～3mL自制琼脂后放入离心机中，以1 500r/min离心15min静置后,用回形针轻轻刮动细胞快使其脱离管壁，用纱布包裹，放入10%中性福尔马林固定后入脱水机处理，常规包埋，切片，苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。

1.2.3第二代杂交捕获技术法

利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测，一次性检测13种高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)型别。步骤如下：①碱性溶液破坏病毒DNA，双链被释放并分解为核苷酸单链；②DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交复合物；③第一抗体(特异性抗体)将RNA-DNA杂交复合物固定在微孔壁上；④结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA-DNA杂交复合物结合使信号放大；⑤碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量从而确定RNA-DNA的含量：⑥ 结果判定：HPV DNA≥1.0pg/mL即判定为阳性。

1.2.4免疫组化P16法

P16抗体及EnVision试剂盒均采自基因有限公司，免疫组化操作步骤按试剂盒说明书进行。阳性判断标准以上皮细胞核，细胞质呈棕黄色为阳性，阳性细胞数>5个为阳性。

2结果

在156例TCT初步诊断为NILM，最后通过细胞块P16联合HC2结果，复查TCT发现不除外高度病变的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion，ASC-H)，高度鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)检出率为19.23%(30/156)，见图1、图2和表1。

注：细胞量少，标本满意度低，镜下无法显示异型细胞。

注：制作成细胞块后HE染色，发现细胞量多，聚缩成团，可见异型鳞状细胞。

表1 HC2联合细胞块P16检测初检TCT为NILM病例结果[n(%)]

3讨论

3.1 TCT检查优缺点及细胞块技术的优点

TCT检查是目前国际上较先进的一种宫颈癌细胞学检查技术，与传统的宫颈刮片巴氏涂片检查相比明显提高了标本的满意度及宫颈异常细胞检出率。然而有文献报道，细胞学诊断与组织学诊断总符合率仅为60%～70%[3]，如何增加诊断的准确率减少漏诊率是令人关注的问题，TCT筛查中，部分标本黏液，血液多和上皮细胞少等缺点在制片过程中始终存在(见图1)，而细胞块技术能很好的解决这一系列的问题，细胞块采集细胞多，它能使细胞聚缩成团，细胞的组织碎片经高度浓缩后形成组织学模式，细胞分布适中，不会出现重叠现象，经过HE染色后结构更为清晰，更易发现异型细胞，因此在一定程度上弥补了细胞学诊断的局限性(见图2)。而且细胞块制片背景干净，对阳性胞质、胞核、胞膜均易识别，更清晰见到组织碎片，可以帮助判断宫颈病变的严重程度。

3.2 HC2在宫颈癌及癌前病变筛查中的优势

众所周知，HPV持续感染是子宫颈癌和癌前病变发生的主要因素，它通过两个致癌蛋白E6，E7结合多种细胞周期调节蛋白和信号传导蛋白，使DNA受损的细胞发生异常增殖，导致肿瘤形成。HC2是经过美国食品和药品监督管理局(U.S. Food and Drug Administration,FDA)，欧洲CE(Conformite Europeenne，CE)和中国食品药品监督管理局(State Food and Drug Administration，SFDA)共同认证的检测技术[4]。其检测灵敏度高，特异性好，重复性和客观性强等特点，能有效的检测出13种高危型病毒，已经成为宫颈癌病因学筛查方法并已广泛使用。但其方法是HPV检测，是病因学检测，主要反映患者当前是否感染HPV，并不能实际反映病毒的致癌能力。最近研究也发现，高危型HPV的病毒负荷量增高与宫颈病变的严重程度的增加相关，但与宫颈癌的预后关系目前尚无定论[5]。

3.3 P16蛋白在子宫颈癌及癌前病变中的表达

P16基因蛋白通过与细胞周期蛋白D竞争，特异性结合CDK4/6并抑制其活性组织细胞进入G/S期，负调节细胞增殖及分裂，从而达到抑癌作用。HPV持续感染状态是Rb基因与其致癌蛋白E7结合后失活，破坏P16的负反馈，导致P16过表达[6]，细胞将持续增殖形成肿瘤。Juric等[7]研究表明，P16表达与子宫颈癌及癌前病变的发生起着重要作用。国外已有学者将P16免疫组织化学染色成功得应用于宫颈细胞学[8]，认为其诊断高级别宫颈癌前病变的敏感性和特异性都较高。但从实验数据也表明，几例细胞块切片上也同样未见异型细胞，分析原因可能是细胞本身数量少或者细胞块面积有限，该切片刚好未包含异型细胞，对此情况要采取多人会诊讨论，以提高准确性。

因此，通过实验数据表明，HC2和细胞块P16技术两种方法联合运用有效地提高了宫颈癌及癌前病变筛查的敏感性和准确性，减少漏诊率，能较早的发现高危人群，做到早发现，早治疗，减少早期宫颈癌及癌前病变的发生发展。

[1]孔建平,罗柳珍.薄层液基细胞学检查对宫颈病变的诊断价值[J].中国妇幼健康研究,2013,24(3):366-368

[2]吴共发,郑娜芬,叶梓莹,曾宇婷,等.细胞块在宫颈液基细胞学疑难病例中的应用价值[J].实用医学杂志,2014,30(23):3823-3825

[3]苏学英,陈志强.细胞穿刺诊断中应用细胞块的价值分析[J].中华病理学杂志,2003,32(1):55-56

[4]戈文舜,任丽芳,李美平,蔡红光,等.细胞块P16联合高危型HPV检测在ASCUS患者分流管理中的作用[J].临床与实验病理学杂志,2014,30(8):868-870

[5]张宏,王毅,张守波,丁亚丽.P16蛋白及二代杂交捕获法检测人乳头状瘤病毒在宫颈病变诊断中联合运用分析[J].山西医药杂志,2015,44(22):2644-2645

[6]廖光东,郄明蓉．p16ink4蛋白在子宫颈上皮内瘤变诊断和转归预测中的应用进展[J]．中华妇产科杂志,2013,48(11):875-6．

[7]Juric D, Mahovlie V, Rajhvajn S,etal. Liquid-based cytology-new possibilities in the diagnosis of cervical lesions[J]. CoilAntropol, 2010, 34(1):19-24.

[8]Tabrizi S N,Tan S E,von Knebel Doeberitz C,etal.Evalua-tion of P16INK4a immunostaining for the detection of high-g rade changes in cervical cytology[J].Pathology,2015,47(4):314-319.

[专业责任编辑：张冠军]

Application of HC2 combining P16 of cell block in liquid-based cytology diagnosis

LU Bo, BAO Lei, LI Mei-ping, SHEN Yin, REN Li-fang, ZHANG Peng

(ShaoxingMaternityandChildHealthHospital,ZhejiangShaoxing312000,China)

Objective To explore the value of immunocytochemistry P16 of cell block combining hybrid capture Ⅱ (HC2) in testing high-risk HPV in cervical liquid-based cytology. Methods Totally 156 cases whose initial cervical cytology interpretation as negative for intraepithelial lesion or malignancy (NILM) were selected. The remains of liquid of TCT were used to make cell block for immunocytochemistrically P16 test. And the cases accepted HC2. Results HC2 were all positive in 156 patients with cervical cytology interpretation as NILM. Detection rate of high-grade squamous intraepithelial lesion was 19.23% (30/156) by immunocytochemistry P16 of cell block and TCT again. Conclusion TCT together with HC2 and immunocytochemistry P16 of liquid-based cytology cell block can effectively enhance the accuracy of cervical cancer and precancerous lesions screening and reduce missed diagnosis rate.

cell block; protein P16; liquid-based cytology; hybrid capture Ⅱ(HC2)

2017-01-13

鲁 波(1983—)，男，主管技师，主要从事病理技术工作。

包 磊，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.046

R711.7

A

1673-5293(2017)08-1023-02