无尾果黄酮类化学成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析※

● 朱继孝 文 乐 魏春华 慕泽泾 钟国跃 曾金祥

无尾果黄酮类化学成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析※

● 朱继孝*文 乐 魏春华 慕泽泾 钟国跃 曾金祥▲

目的：通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对无尾果中的化学成分进行定性分析。方法：采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS，YMC-ULtraHT Pro C18色谱柱(100 mm×3 mm，2μm)以甲醇-0.5%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱；质谱采用电喷雾(ESI)离子源，在负离子模式下采集数据，通过保留时间、精确分子离子峰和二级质谱裂解碎片，对无尾果进行成分鉴定。结果：初步鉴定了无尾果中10个黄酮类成分。结论：UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法能快速鉴别无尾果中的黄酮类化学成分，该方法简单、快速，结果准确，为无尾果的药效物质研究奠定基础。

无尾果 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 化学成分 裂解规律 黄酮

无尾果(ColurialongifoliaMaxim),藏药名为热衮巴，是蔷薇科无尾果属的植物，分布于中国大陆的甘肃、云南、西藏、四川、青海等地，全草入药，有止血止痛、清热作用。藏药志记载，热衮巴能治疗高血压引起的发烧、神经性发烧、疝痛等，具有清热解毒功效[1]。无尾果在藏区使用广泛。目前国内外对于无尾果化学成分的研究并不多见。本课题组前期对无尾果的抗炎、镇痛、解热作用进行了研究。前期研究结果表明，无尾果具有显著的抗炎、镇痛、解热作用，其抗炎作用与提高抗氧化能力、抑制脂质过氧化、抑制炎症因子TNF-α、PGE2的释放有关。但其药效物质基础仍不清楚，限制了无尾果的进一步开发与应用。因此，建立一种有效、准确的方法对无尾果进行化学成分研究具有重要意义。近年来，液质联用在中药领域应用广泛，已成为分离鉴定各种化合物的重要手段之一[2-3]。液质联用技术弥补了传统检测器的不足，它集LC的高分离能力和MS的高灵敏度、高选择性于一体[4]。因此，本实验以无尾果为研究对象，应用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术对无尾果甲醇提取物的化学成分进行研究，根据其准分子离子以及二级碎片离子、文献数据等鉴定无尾果的化学成分，并总结其质谱裂解规律，为无尾果活性成分的鉴定和研究提供科学依据，同时为藏药化学成分的研究奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1仪器岛津LC-30A超高效液相色谱仪，PDA紫外检测器；Triple-TOF 5600+高分辨质谱仪，配备 ESI 离子源及 Analyst 1.6 数据处理软件、PeakView数据处理软件(A美国B SCIEX 公司)；KQ-5200DB 型超声清洗机(昆山市超声波仪器公司)；AL204 型电子分析天平(Mettler Toledo 仪器(上海)有限公司)； Millipore-Simplicity 超纯水处理系统(德国默克密理博公司)。

1.2药物与试剂异槲皮苷对照品(纯度≥98%，批号：MUST-16051010)、金丝桃苷对照品(纯度≥98%，批号：MUST-16032113)、木犀草素对照品(纯度≥98%，批号：MUST-16011015)均购自成都曼思特生物科技公司；甲醇( HPLC 级，美国天地有限公司)，甲酸( HPLC 级，山西西亚化工有限公司)，水为Milli-Q 系统纯化水(美国Millipore 公司)。

无尾果由课题组采自云南怒江贡山县，经江西中医药大学钟囯跃研究员鉴定为蔷薇科无尾果属植物无尾果 (C.longigoliaMaxim)的干燥全草。

2 方法

2.1供试品溶液制备无尾果粉碎，称取约2.0g置于50mL锥形瓶，加入25mL 75% 甲醇超声提取45min，抽滤、旋干、定容至5mL容量瓶中，取定容后药液过0.22μm 微孔滤膜过滤，供UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.2标准品溶液的制备分别精密称取2mg对照品(金丝桃苷、异槲皮苷、木犀草素)于5mL容量瓶中，用75%甲醇溶解稀释至刻度，过0.22μm微孔滤膜，待分析。

2.3 LC-MS条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱：YMC-ULtraHT Pro C18 色谱柱(100 mm×3 mm，2μm)；流动相：0.5%甲酸水溶液(A)，甲醇(B)，梯度洗脱：0～30min，8%～60% B；30～40min，60%～95% B；40～42min，95%～8% B；42～47min，8%～8% B；流速：0.4mL/min；柱温：32℃；进样量：4μL。

2.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化源(ESI)，负离子模式；质量扫描范围m/z100～1000；喷雾电压：-4500V，雾化气温度：500℃，气帘气：140.745kPa，辅助气：344.74 kPa；去簇电压(DP)：-100V；采用AB analyst TF软件采集数据，TOF/MS 一级预扫描和触发的二级扫描TOF/MS/MS 离子累积时间分别为200、100 ms，碰撞能量CE为40eV，CES碰撞能量叠加为(40±10)eV。

2.4数据处理采用AB Sciex公司 Peak View 1.6软件，对UHPLC-Q-TOF-MS/MS采集的数据进行处理。

3 结果

3.1无尾果化学成分分析采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 对75%甲醇提取无尾果药材成分进行定性分析，(-) ESI-MS 的质谱总离子流图(TIC)见图1。应用Peak View 1.6软件分析75% 甲醇提取无尾果中各化学成分的保留时间及其质谱信息，并结合分子离子峰与对照品、相关文献报道数据进行对比，对其中的化学成分进行确认，初步鉴定出无尾果提取物中黄酮类化合物10个，见表1。

图1 无尾果提取物在负离子模式下总离子流图

PeaknoCompoundidentityFormulaRt(min)Error(ppm)FoundatMass(Da)Fragmentionsm/z1CatechinhydrateC15H14O68．974．4289．0712245．0826、203．0715、187．0398、161．06032HyperosideC21H20O1220．751463．0681301．0351、272．0322、255．0299、243．0294、178．9990、151．00463MiquelianinC21H18O1320．860．5477．0678301．0362、151．0052、178．99934Apigenin7-glucosideC21H20O1022．470．6431．0966311．0581、269．0454、225．0572、200．0450、5QuercetinC15H10O726．573．1301．0363273．0393、178．9981、151．00436LuteolinC15H10O627．752285．0410257．0450、229．0501、151．00467TilirosideC30H26O1328．230．6593．1304447．0940、327．0516、307．0829、285．0415、284．0332、255．0304、227．0351、163．04018KaempferolC15H10O629．821．6285．0399257．0562、257．0453、229．0311、211．0405、187．04209ApigeninC15H10O530．312．1269．0461241．0467、225．0548、201．0541、197．0445、159．045910IsorhamnetinC16H12O730．612．8315．0519300．0275、283．0245、151．0048

3.2化合物的质谱裂解特征化合物1tR为8.97min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z289.0712 [M-H]-，其分子式为C15H14O6，分子离子峰失去CO2得到碎片离子m/z245.0826，碎片离子m/z245.0826分别失去C2H2O、C3H6O得到碎片离子m/z203.0715、187.0398。碎片离子m/z203.0715失去C2H2O得到碎片离子m/z161.0603，裂解规律与文献一致。因此，可以推测为儿茶素[5]。

化合物2tR为20.75min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z463.0681 [M-H]-，其分子式为C21H20O12，二级图谱与标准品一致，二级图谱碎片离子峰为m/z301.0351、300.0278、271.0246、255.0299、243.0294、178.9990、151.0046。根据二级碎片离子m/z301.0351、300.0278、272.0322、255.0290、243.0294、178.9990、151.0046推测为槲皮素母核，分子离子峰,m/z463.0681失去一分子葡萄糖得到m/z301.0351，而m/z301.0351强度高于m/z300.0278和碎片离子m/z271.0254、255.0299，可以推测糖连接在3位，见图2a。因此，推测此化合物为金丝桃苷[6]。

化合物3tR为20.86min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z477.0747[M-H]-，其分子式为C21H18O13，分子离子峰失去一分子葡萄糖醛酸得到碎片离子m/z301.0362，根据碎片离子m/z179.0344、151.0052、150.9874推测m/z301.0362为槲皮素母核。因此，推测化合物3为槲皮素-3-0葡萄糖醛酸，裂解规律与文献一致[6]。

化合物4tR为22.47 min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z431.0970 [M-H]-，其分子式为C21H20O10，分子离子峰失去C4H8O5得到碎片离子m/z311.0581，失去一分子葡萄糖得到碎片离子m/z269.0454。碎片离子m/z269.0454分别失去CO2和C3O2得到碎片离子m/z225.0572、200.0450，推测化合物4为芹菜素7-O-葡萄糖苷,裂解规律与文献一致[7]。

化合物5tR为26.57 min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z301.0363 [M-H]-，其分子式为C15H10O7，分子离子峰m/z301.0363 分别失去CO、C7H6O2得到碎片离子m/z273.0405、178.9982，碎片离子m/z178.9982失去CO得到碎片离子m/z151.0042，推测此化合物为槲皮素，裂解规律与文献一致[8]。

化合物6tR为27.75 min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z285.0399 [M-H]-，其分子式为C15H10O6，二级图谱与对照品一致，分子离子峰失去CO得到碎片离子m/z257.0562，碎片离子m/z257.0450失去CO得到碎片离子m/z229.0509。碎片离子m/z285.0399发生RDA裂解得到碎片离子m/z151.0051、133.0291，推测此化合物为木犀草素，见图2b，裂解规律与文献一致[9]。

化合物7tR为28.23min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z593.1304 [M-H]-，其分子式为C30H26O13，碎片离子峰为m/z447.0940、327.0516、307.0829、285.0415、284.0332、255.0304、227.0351、145.0296，分子离子脱去C9H6O2得到碎片离子447.0940，碎片离子m/z447.0940进一步脱去C6H10O5产生碎片离子m/z285.0415，推测中性丢失为葡糖糖基。由碎片离子m/z285.0415、284.0332、255.0304、227.0351可以推断为山奈酚母核。因此，推测此化合物为银锻苷[9]。

a 金丝桃苷

b 木犀草素

c芹菜素

化合物8tR为29.82min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z285.0399 [M-H]-，其分子式为C15H10O6，分子离子峰m/z285.0399分别失去CO、C4H4O3得到碎片离子m/z257.0450、187.0395，碎片离子m/z257.0450分别失去CO和HCOOH得到碎片离子m/z229.0501、211.0395，推测化合物8为山奈酚，裂解规律与文献一致[10]。

化合物9tR为30.31min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z269.0405[M-H]-，其分子式为C15H10O5，分子离子峰m/z269.0405分别失去CO、CO2、C3O2、C2O3得到碎片离子m/z241.0467、225.0548、201.0541、197.0445，碎片离子m/z201.0541失去C2H2O得到碎片离子m/z159.0459，见图2c，推测化合物9为芹菜素，裂解规律与文献一致[11]。

化合物10tR为30.61min，负离子模式下，高分辨ESI-MS准分子离子峰为m/z315.2549 [M-H]-，其分子式为C16H12O7，分子离子峰m/z315.2549失去CH3得到m/z300.0275，碎片离子m/z300.0275失去H2O得到碎片离子m/z283.0246，先失去C7H6O再失去CO得到碎片离子m/z151.0048，推测化合物10为异鼠李素，裂解规律与文献一致[12]。

4 讨论

藏药具有疗效明显、毒副作用小、资源丰富易得等优点，属我国较有影响、较为完整的民族药之一。而无尾果化学成分相关的报道仍属空白。

UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术为化合物的鉴定提供了一种全新方法，与传统化学成分分离鉴别方法相比操作简便、快速、准确，已成为中药药效成分发现与鉴别的有力工具。本实验分析了无尾果甲醇提取物成分的质谱行为，鉴别了10种黄酮类化合物。并进一步发现以槲皮素为母核的化合物如槲皮素-3-0葡萄糖醛酸、金丝桃苷，其特征碎片离子为m/z301；芹菜素，其特征碎片离子为m/z269；木犀草素，其特征碎片离子为m/z285，为后续黄酮类化合物的鉴别提供了参考依据。

黄酮类化合物具有抗炎、镇痛、抗氧化、保肝、抗病毒等活性[13]，如金丝桃苷具有抗炎镇痛的作用且通过抑制NF-κB的活化产生抗炎作用[14]；木犀草素具有抗炎镇痛保护神经的作用，其能降低炎症因子转录调节因子的活性，减少促炎细胞因子和炎症介质的产生[15]。这表明本实验推断出的黄酮类化合物，在一定程度上阐明了无尾果的抗炎镇痛药效成分，为无尾果的药理活性乃至质量控制提供了初步物质依据。从总离子流图可以看出，仍有大量成分尚待进一步解析，说明无尾果可能还存在其它抗炎镇痛药效成分，相关工作正在进行之中。

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江西民族药现代科技与产业发展协同创新中心开放基金项目(No.JXXT201402021)

朱继孝，男，副教授，硕士研究生导师。研究方向：中药与民族药有效成分与作用机理。

▲通讯作者曾金祥，男，副教授，硕士研究生导师。研究方向：中药与民族药物质基础与质量标准。Email：zjinxiang@163.com

江西中医药大学中药资源与民族药研究中心(330004)