热毒宁注射液灭菌前后无菌情况的观察

张道利　高晓艳　姚青

摘要：目的 考察灭菌过程对样品无菌保证水平的控制效果。方法 采用外加阳性菌金黄色葡萄球菌的方法，按照《中国药典》2010 年版无菌检查法进行方法学验证试验。结果 经过10次验证试验得出，灭菌工序对微生物去除明显，去除率达到100.00%。结论 经过10次验证试验，得出灭菌工序对微生物去除明显，能够有效的截留微生物，有效确保热毒宁注射液的无菌安全性。

关键词：热毒宁注射液；无菌检查；灭菌

中图分类号：R286 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）17-0093-03

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验仪器 所需实验仪器包括HTY-2000A型集菌仪（编号：424049，杭州泰林生物技术设备有限公司），PY一次性使用全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司），双人净化工作台YJT（编号：424094，靖江市磊鑫机械厂），生物安全柜（编号：424076，苏州市华宇净化设备有限公司），脉动真空灭菌器DMG-0.28（编号：424013，连云港千樱公司），生化培养箱LRH-250（编号：424164，上海一恒科技有限公司），霉菌培养箱MJ-250-1（编号：424158，上海一恒科技有限公司）。

1.1.2实验培养基 硫乙醇酸盐流体培养基（批号：20140221，宜兴市永信生物有限公司），改良马丁培养基（批号：20140222，宜兴市永信生物有限公司），改良马丁琼脂培养基（批号：2014082，宜兴市永信生物有限公司），营养琼脂培养基（批号：20141110，宜兴市永信生物有限公司），营养肉汤培养基（批号：20140831，宜兴市永信生物有限公司），热毒宁注射液（规格：10 ml/支，批号：150206、150207、150208、150209、150210、150301、150302、150303、150304、150305，江苏康缘药业股份有限公司）。

1.1.3实验菌种 枯草杆菌CMCC（B）（编号：63501-4，江苏康缘药业股份有限公司），金黄色葡萄球菌CMCC（B）（编号：26003-4，江苏康缘药业股份有限公司），大肠埃希菌CMCC（B）（编号：44102-4，江苏康缘药业股份有限公司），生孢梭菌 CMCC（B）（编号：64941-4，江苏康缘药业股份有限公司），白色念珠菌CMCC（F）（编号：98001-4，江苏康缘药业股份有限公司），黑曲霉CMCC（F）（编号：98003-4，江苏康缘药业股份有限公司）。

1.2方法

1.2.1灭菌工序去除细菌数 取热毒宁注射液（批号：150206）10批灭菌前后药液适量进行无菌检查[1]。结果显示，灭菌前后热毒宁注射液中微生物含量太低，无法评估灭菌工序对微生物的吸附效果，因此，采用加阳性菌的方法在灭菌前药液中加入适量金黄色葡萄球菌数，并模拟生产过程中灭菌工序进行操作[2]。

取灌封后灭菌前药液，加入金黄色葡萄球菌数适量，使灭菌前药液中含外加阳性菌含量<100 cfu/ ml，混匀，作为灭菌前供试液，备用。开启灭菌检漏器，按设定的程序进行灭菌：灭菌温度100 ℃，置换温度95 ℃，灭菌时间45 min，清洗时间20 min，检漏时间5 min，灭菌真空度-0.080 MPa，灭菌压力0.020 MPa。灭菌温度为100 ℃，时间为45 min。得到灭菌后供试液。分别取灭菌前供试液（C1）和灭菌后供试液（C2），以无菌检查法检测其中的微生物含量，并按以下公式计算：微生物去除率 Q1=（C1-C2）/C1×100%。

1.2.2菌液制备方法[3-4] ①取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]第4代新鲜肉汤培养基1 ml+9 ml 0.9%无菌NaCl溶液，10倍系列稀释至10-7，制成每1 ml含菌数为95 cfu、87 cfu、85 cfu的菌悬液各30 ml，备用；②取大肠埃希菌[CMCC（B）44102]第4代新鲜肉汤培养基1 ml+9 ml 0.9%无菌NaCl溶液，10倍系列稀释至10-7，制成每1 ml含菌数为73 cfu、69 cfu、82 cfu的菌悬液各30 ml，备用；③取枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]第4代新鲜肉汤培养基1 ml+9 ml 0.9%无菌NaCl溶液，10倍系列稀释至10-6，制成每1 ml含菌数为69 cfu、61 cfu、64 cfu的菌悬液各30 ml，备用；④取生孢梭菌[CMCC（B）64941]第4代新鲜肉汤培养基1 ml+9 ml 0.9%无菌NaCl溶液，10倍系列稀释至10-5，制成每1 ml含菌数为47 cfu、51 cfu、34 cfu的菌悬液各30 ml，备用；⑤取白色念株菌[CMCC（F）98001]第4代新鲜肉汤培养基1 ml+9 ml 0.9%无菌NaCl溶液，10倍系列稀释至10-6，制成每1 ml含菌数为97 cfu、90 cfu、88 cfu的菌悬液各30 ml，备用；⑥取黑曲霉菌[CMCC（F）98003]第4代改良马丁琼脂斜面培养物，加入5 ml含0.05%的聚山梨酯80 ml的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出1 ml孢子悬液新鲜肉汤培养基1 ml+9 ml 0.9%无菌NaCl溶液，10倍系列稀释至10-5，制成每1 ml含菌数为64 cfu、61 cfu、58 cfu的菌悬液[5-6]各30 ml，备用。菌液制备结果见表1。

1.2.3供试品溶液的制备 取热毒宁注射液240支，通过HTY-2000A型集菌仪平均过滤置6个APY一次性使用全封闭集菌培养器中。

1.2.4薄膜过滤 ①安装好APY一次性使用全封闭集菌培养器，每2个一组，共6组；②调节HTY-2000A型集菌仪泵速为160 r/min，用适量的pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜；③一个APY一次性使用全封闭集菌培养器取热毒宁注射液20支直接过滤样品溶液；④在APY一次性使用全封闭集菌培养器中加入<100 cfu/ml的试验菌金黄色葡萄球菌；⑤根据6种试验菌的类别选择相应的培养基加入到APY一次性使用全封閉集菌培养器中；⑥在另一APY一次性使用全封闭集菌培养器中加入等量的对应培养基和金黄色葡萄球菌悬液；⑦其余五株试验菌按上述方法同法操作；⑧培养：将6组APY一次性使用全封闭集菌培养器分别置规定温度的培养箱中培养3～5 d，观察试验组和对照组的微生物生长情况[6-7]。endprint

2 结果

与对照组比较，试验组菌落生长情况良好，说明热毒宁注射液在此检验量和检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计。因此，可以按照此检查条件采取薄膜过滤检查法进行热毒宁注射液的无菌检查[5-6]。灭菌工序去除细菌数的检测结果见表2、表3。试验结果见表4。

3讨论

根据药理学试验表明，热毒宁注射液对2，4-二硝基苯酚，三联疫苗导致家兔发热存在解热效果，大肠杆菌导致大鼠发热，能够使流感病毒造成小鼠平均存活时间得到延长，降低流感病毒对于小鼠肺感染指数，通过能够降低金黄色葡萄球菌感染小鼠以及肺炎克雷伯氏菌感染小鼠的死亡几率，对于二甲苯引发的小鼠耳廓肿胀起到抑制作用，提升小鼠血清碳粒廓清指数，增强血清溶血素水平，提高羊红细胞引发小鼠迟发型超敏反应，对于醋酸引发小鼠扭体疼痛反映起到抑制效果。热毒宁注射液制备过程中对微生物有多步控制程序，活性炭吸附、超滤膜的使用、过程中的干热灭菌柜和隧道烘箱的使用、除菌过滤滤芯的使用、层流的保护、隔离器的使用、酸碱的使用、环境的熏蒸（臭氧、丙二醇）、消毒剂的使用等[7]。本实验中采用外加阳性菌金黄色葡萄球菌的方法，经过10次验证试验，得出灭菌工序对微生物去除明显，去除率达到100.00%，能够有效的截留微生物，有效的确保热毒宁注射液的安全性。

参考文献：

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典[M].一部.北京：化學工业出版社，2010：76-79.

[2]国家食品药品监督管理局药品认证管理中心.药品GMP指南[M].北京：中国医药科技出版社，2011.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：337.

[4]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：科学出版社，2000：321-325.

[5]张道利，高晓艳，姚青，等.曲克芦丁注射液无菌检查法方法学研究[J].医学信息，2015（01）：151-152.

[6]姚青，张道利，范庆龙，等.羚羊角注射液无菌检查法方法学研究[J].世界最新医学信息文摘，2014，14（36）：249-250.

[7]许真玉.注射剂灭菌工艺变更常见问题分析[J].中国新药杂志，2014，23（11）：1248-1251.

编辑/张建婷endprint