槲皮素对TNF-α诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖及P38MAPK、HMGB1蛋白表达的影响

章 春，冯 健，李家富△

(1.重庆市合川区人民医院心内科 401520；2.西南医科大学第一附属医院心内科,四川泸州 646000)

槲皮素对TNF-α诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖及P38MAPK、HMGB1蛋白表达的影响

章 春1，冯 健2，李家富2△

(1.重庆市合川区人民医院心内科 401520；2.西南医科大学第一附属医院心内科,四川泸州 646000)

目的 研究槲皮素对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的心肌成纤维细胞增殖及P38MAPK、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的影响。方法 通过胰酶消化法和差速贴壁法获得纯化的心肌成纤维细胞，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测心肌成纤维细胞的增殖，采用Western blot法测定P38MAPK、HMGB1蛋白的表达。结果 槲皮素对基础状态下的心肌成纤维细胞的增殖无影响，但对TNF-α诱导的心肌成纤维细胞的增殖有抑制作用，且各组细胞的吸光度(A)值随槲皮素浓度的增加而减小(P<0.05)，各组细胞P38MAPK、HMGB1蛋白表达随槲皮素浓度的增加而减弱(P<0.05)。结论 槲皮素对TNF-α诱导的心肌成纤维细胞增殖有一定地抑制作用，其机制可能是通过P38MAPK信号通路抑制HMGB1的表达，参与抑制心肌成纤维细胞的增殖。

槲皮素；成纤维细胞；心肌;心室重构；高迁移率族蛋白类；丝裂素活化蛋白激酶

心脏重塑是临床多种心血管疾病发展的终末病理表现，也是引起心功能不全和心力衰竭的内在原因。心脏重塑主要包括两方面的结构变化：心肌肥厚和心肌纤维化。其中，心肌成纤维细胞(CFs)是致心肌纤维化的主要作用细胞，心肌成纤维细胞增殖及细胞外基质沉积是心肌纤维化的主要表现，因此，抑制心肌成纤维细胞过度增殖是防止或逆转心脏重塑发生发展的关键之一。槲皮素属黄酮类化合物，存在于许多植物的花、叶、果实中，在心血管疾病治疗方面具有广泛的药理作用，如降血压、抗氧化、抗血小板聚集、抗炎等，对心肌肥厚和心肌纤维化也有一定的逆转作用[1-3]。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为一种新发现的晚期炎性介质，可诱导细胞的迁移、分化和再生，导致细胞骨架重建，介导炎性反应，与缺血性心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心室重塑等密切相关[4-6]。因此，本研究旨在探索槲皮素对心肌成纤维细胞的影响及HMGB1在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 出生1～4 d SPF级SD大鼠乳鼠[由西南医科大学城北动物房提供,生产批号SCXK(川)2013-17]，胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(美国Sigma公司)，重组人肿瘤坏死因子α(TNF-α)(Pepro Tech公司)，槲皮素(产品号1001182803，美国Sigma公司)，DAPI溶液(江苏碧云天公司)，兔抗大鼠多克隆波形蛋白抗体(Bioworld公司)，羊抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG(北京中杉金桥生物技术公司)，P38MAPK抑制剂(SB203580，江苏碧云天公司)，P38MAPK抗大鼠单抗、兔抗大鼠HMGB1抗体(Cell Signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代CFs培养 在无菌条件下解剖1～4 d SD大鼠乳鼠，取出心脏，放入盛有PBS液的容器中，反复冲洗，修剪心脏周围的神经、血管、心房等，冲洗干净，将心脏剪碎，用37 ℃ 0.125%胰蛋白酶消化分离心脏碎块，用吸管反复吹打，收集上清液装入干净离心管(此步骤反复，直至碎块消失)，加入等体积含10%胎牛血清的培养液终止消化，800 r/min离心5 min,弃上清液，收集细胞沉淀并用10%胎牛血清制成细胞悬液，放入37 ℃、5% CO2孵箱中孵育150 min，利用差速贴壁法获得心肌成纤维细胞，细胞生长融合90%以上按1∶2或1∶3消化传代，将第2～4代细胞用于实验。

1.2.2 细胞鉴定 用兔抗大鼠多克隆波形蛋白抗体通过免疫荧光法，在荧光显微镜下观察心肌成纤维细胞的形态，结合其生物学特性鉴定为CFs。

1.2.3 实验分组 取生长良好的第2、3代细胞，设置成两部分，第1部分：空白对照组(不加任何干预因素)、槲皮素各浓度组(25、50、75、100 μmol/L)；第2部分：空白对照组(不加任何干预因素)、TNF-α组(终浓度为10 ng/mL)、TNF-α+槲皮素各浓度组(25、50、100 μmol/L)、TNF-α+SB203580组(浓度为10 μmol/L)。

1.2.4 四甲基偶噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力 取对数生长期的CFs，0.25%胰酶消化制成细胞悬液，细胞计数并调整细胞悬液浓度，接种于96孔板(每组设4个复孔，重复3次)，药物干预24 h，于干预结束4 h前，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL,孵箱继续培养4 h,弃孔中培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，避光震荡10 min，在酶联免疫吸附仪波长为490 nm处测定各组细胞吸光度(A)值，了解细胞增殖情况。

1.2.5 Western blot法检测各组细胞P38MAPK、HMGB1蛋白表达 取出各组细胞，PBS洗涤3次，加入150～250 μL已配制好的裂解液，冰上静置15 min，吸去含蛋白的裂解液放入一新EP管，放入4 ℃ 14 000×g低温离心机离心15 min，上清液即为蛋白，根据碧云天BCA法建立标准曲线测定蛋白浓度，制备蛋白样品后上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳结束后将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后用TBST稀释的抗大鼠P38MAPK单抗(1∶1 000)、兔抗大鼠HMGB1抗体(1∶1 000)、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗分别孵育1 h，电化学发光(ECL)荧光显像，记录结果，并用Quantity One软件分析。

2 结 果

2.1 原代心肌成纤维细胞的培养及鉴定 成功分离培养得到的原代CFs生长至第2天，在倒置显微镜下观察呈椭圆形或不规则形，细胞体较大，细胞质透明，多核，无自发性搏动(图1)。经染色后的细胞在荧光显微镜下观察可见：细胞呈长梭形，细胞核被染为蓝色，细胞质被染为红色，结合波形蛋白强阳性反应结果可确定为CFs(图2、3)。

图1 细胞生长第2天(白光×200)

图2 荧光显微镜下细胞核(DAPI×400)

图3 荧光显微镜下细胞质(×400)

A：P38MAPK Western blot图；B：HMGB1 Western blot图；C：P38MAPK蛋白表达分析图；D：HMGB1蛋白表达分析图；1：TNF-α组；2：TNF-α+榭皮素 25 μmol/L组；3：TNF-α+榭皮素 50 μmol/L组；4：TNF-α+榭皮素 100 μmol/L组；5：TNF-α+SB203580组；6：对照组。a：P<0.05，与TNF-α组比较；b：P<0.05，与TNF-α+榭皮素 25 μmol/L比较；c：P<0.05，与TNF-α+榭皮素 50 μmol/L组比较；d：P<0.05，与TNF-α+榭皮素 100 μmol/L组比较。

图4 各组P38MAPK、HMGB1蛋白表达情况

2.2 槲皮素对各组细胞增殖能力影响 MTT法检测不同浓度槲皮素干预CFs 24 h后的细胞增殖情况，结果显示：与对照组(0.270±0.023)比较，槲皮素各浓度组(25、50、75、100 μmol/L槲皮素组A值分别为0.291±0.027、0.278±0.022、0.277±0.025、0.244±0.021)，对基础状态下的CFs增殖无影响(P>0.05)；此外，结果还得出：与对照组(0.267±0.004)比较，TNF-α能明显促进CFs增殖，与TNF-α组(0.523±0.052)比较，TNF-α+槲皮素各浓度组(TNF-α+25、50、100 μmol/L榭皮素组A值分别为0.375±0.046、0.319±0.052、0.063±0.004)CFs增殖能力减弱，且呈浓度依赖性(P<0.05)，差异有统计学意义。

2.3 各组细胞P38MAPK、HMGB1蛋白表达情况 Western blot检测结果显示：与对照组比较，TNF-α组P38MAPK、HMGB1蛋白表达水平明显上调(P<0.05)，与TNF-α组比较，TNF-α+槲皮素各浓度组P38MAPK、HMGB1蛋白表达逐渐下调，TNF-α+SB203580组的蛋白也明显下调(P<0.05)，提示槲皮素能抑制TNF-α诱导的P38MAPK、HMGB1蛋白表达上调，且呈浓度依赖性(P<0.05)，可能是通过阻断P38MAPK信号通路发挥的作用。见图4。

3 讨 论

在心肌纤维化、心室重塑的形成过程中，心肌成纤维细胞为其主要作用细胞，它占心肌组织2/3的成分，参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏的发育、结构、细胞信号传导等密切相关。CFs的过度增殖及细胞外基质合成增加将导致心肌纤维化，最后发展为心力衰竭，严重危害人类健康。目前，越来越多的研究趋向认为，心肌纤维化是一种慢性炎性反应发生、发展的结果。CFs在炎性因子的持续刺激下，可通过信号转导，激活信号通路，分泌更多的炎性介子，发生炎性级联反应，促进心肌纤维化[7-8]。而TNF-α作为一种炎症性的细胞因子，当其作用于细胞时不仅会加速心肌细胞凋亡，刺激CFs增殖[9]，还会促进HMGB1的释放。HMGB1在几乎所有的细胞中都有表达。近年来，HMGB1作为一种新的晚期炎症因子，成为许多疾病研究的热点，在心血管疾病的发生、发展中也受到重视。P38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族体系中的亚系成员，在炎性反应致心肌纤维化的过程中发挥了一定的调控作用[10-11]。有研究利用P38MAPK抑制剂干预大鼠CFs，成功地抑制Ⅰ型胶原蛋白及基质金属蛋白酶-1的表达，抑制CFs增殖，推断P38MAPK信号通路是CFs增殖形成的途径之一。而HMGB1要发挥生物学功能需通过P38MAPK、核因子-κB(NF-κB)等信号通路起作用。结合本实验结果显示，TNF-α不仅能刺激CFs增殖，还能使炎性蛋白HMGB1表达上调，并且可能是通过P38MAPK信号通路参与细胞增殖的。

槲皮素作为一种具有多种心血管药理作用的药物而被广泛研究，其抑制细胞增殖作用也受到学术界关注。大量的研究显示，槲皮素对血管紧张素-Ⅱ、转化生长因子-β等多种因素引起的CFs增殖及基质金属蛋白酶的分泌具有抑制作用[12-14]，从而起抗纤维化作用。研究结果显示，槲皮素对正常生理状态下的CFs增殖无影响，但呈浓度依赖性地抑制TNF-α诱导的CFs增殖。槲皮素各浓度组P38MAPK、HMGB1蛋白表达下调，呈浓度依赖性，加入P38MAPK抑制剂(SB203580)后，可抑制TNF-α促进的CFs增殖程度，并部分抑制P38MAPK、HMGB1蛋白表达。因此，通过P38MAPK途径TNF-α可促进CFs增殖、HMGB1表达，使胶原蛋白合成增加、炎性反应加重，从而导致心肌纤维化。

综上所述，槲皮素能够抑制TNF-α诱导的乳鼠CFs增殖，其机制可能是通过P38MAPK信号途径，抑制HMGB1蛋白表达而发挥作用的，这为槲皮素在今后的临床干预、防治心肌纤维化提供了实验依据。

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Effects of quercetin on proliferation and expression of P38MAPK and HMGB1 protein in neonatal rat cardiac fibroblasts induced by TNF-α

ZhangChun1,FengJian2,LiJiafu2△

(1.DepartmentofCardiology,People′sHospitalofHechuanDistrict,Chongqing401520,China;2.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To study the effect of quercetin on proliferation and expression of P38MAPK and HMGB1 protein in neonatal rat cardiac fibroblasts induced by TNF-α.Methods Purified cardiac fibroblasts were obtained by trypsin digestion and differential adherence method.The proliferation of cardiac fibroblasts was detected by MTT assay.The expression of P38MAPK and HMGB1 protein was detected by Western blot.Results Quercetin had no effect on the proliferation of cardiac fibroblasts in the basal state but inhibited the proliferation of cardiac fibroblasts induced by TNF-α,and theAvalue of each group was increased with the increase of quercetin concentration(P<0.05).The exspression of P38MAPK、HMGB1 were decresed with the icrease of quercetin.Conclusion Quercetin may inhibit the proliferation of cardiac fibroblasts induced by TNF-α.The mechanism may be inhibit the expression of HMGB1 through P38MAPK signaling pathway.

quercetin;fibroblasts;myocardiu;ventricular remodeling;high mobility group;proteins;mitogen-activated protein kinase

四川省科技厅国际合作项目(2012HH0011)。

章春(1987-)，住院医师，硕士，主要从事心血管内科工作。

△通信作者，E-mail:516927149@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.006

R542.2+3

A

1671-8348(2017)23-3189-03

2017-03-12

2017-04-13)

论著·基础研究