白细胞介素-17对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL、OPG的影响

李琳娟，黎 敏，彭娟敏，康 娜

(广西医科大学附属口腔医院正畸科，南宁 530021)

白细胞介素-17对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL、OPG的影响

李琳娟，黎 敏，彭娟敏，康 娜△

(广西医科大学附属口腔医院正畸科，南宁 530021)

目的 研究白细胞介素17(IL-17)水平对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)中细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)表达的影响，探讨IL-17与正畸牙根吸收的相关性。方法 采用组织块培养法，在体外建立人牙周膜成纤维细胞系。以不同水平(0、5、10、20、40 ng/mL)的IL-17作用HPDLF 24 h。采用RT-PCR和ELISA法，分别检测RANKL和OPG的mRNA、蛋白的表达。结果 (1)在0 ng/mL组中,HPDLF表达RANKL、OPG。(2)0～20 ng/mL各组中，HPDLF中RANKL的mRNA、蛋白表达量与IL-17水平呈正相关性。(3)5～20 ng/mL各组中，OPG的mRNA、蛋白表达量与IL-17水平呈负相关性。(4)0～20 ng/mL组中，RANKL/OPG的mRNA、蛋白的比值与IL-17水平呈正相关性。结论 在无IL-17刺激时，HPDLF可表达RANKL、OPG。IL-17能够促进HPDLF表达RANKL，同时抑制HPDLF表达OPG，上调RANKL/OPG的比值。

牙周膜;成纤维细胞；白细胞介素17；RANK配体；骨保护素

正畸相关炎性牙根吸收的重要原因之一是正畸牙移动所致的炎性反应[1]。而白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)主要由辅助性T淋巴细胞17(Th17)分泌，是一种重要的促炎性细胞因子，具有强大的骨吸收作用和促炎症作用[2]。研究表明，人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLF)可以通过表达细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)和骨保护素(osteoprogeterin，OPG)来影响破骨细胞的活动，从而参与破牙骨质细胞的活动并调节牙根吸收过程[3-4]。本实验用逆转录PCR(RT-PCR)法和酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测HPDLF中RANKL、OPG两种因子的mRNA、蛋白的表达情况，观察不同水平的IL-17对HPDLF中RANKL、OPG表达的影响，探讨IL-17与正畸牙根吸收的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清、DMEM培养液(南京维森特生物技术有限公司)，双抗(青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL，北京索莱宝科技有限公司)，鼠抗人细胞角蛋白抗体、鼠抗人波形丝蛋白抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、引物、Taq DNA PCR反应试剂盒(Takara宝生物工程有限公司)，IL-17、RANKL、OPG ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 HPDLF的培养与鉴定 采用组织块培养法进行HPDLF原代培养。培养所需组织均取自本院口腔外科门诊因正畸需要而拔除的前磨牙(牙齿牙周健康、无牙体疾病)。牙齿离体后立即置于预冷的含双抗的DMEM培养液中，于0.5 h内送至实验室。取根中1/3的牙周膜组织，接种于75 mL培养瓶瓶底。竖直培养瓶并加入1.5 mL含20%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内。4～6 h后组织块贴壁牢固，慢慢放平培养瓶，继续培养，细胞贴壁后每隔2～3 d更换1次培养液[5]。当HPDLF爬出后覆盖培养瓶底达80%时进行传代。取第4代细胞，行波形丝蛋白抗体和角蛋白抗体染色，鉴定细胞来源。

1.2.2 IL-17对HPDLF增殖活性的影响 取第4～5代细胞，培养24 h后，分别给予0、5、10、20、40、60、80 ng/mL水平的IL-17作用24 h，采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法检测吸光度(A)值，观察IL-17对HPDLF增殖活性的影响。

1.2.3 实验干预和检测 取第4～6代细胞，制成1×105个/mL的细胞悬液，接种于6孔培养板中，每孔2 mL，常规培养3 d。弃培养液，加入条件培养液进行干预，培养24 h。其中实验组条件培养液所含IL-17的水平分别为5、10、20、40 ng/mL，对照组为0 ng/mL，共5个组，每组设3个重复样品。收集细胞，提取细胞总RNA，取1 μg的RNA逆转录为cDNA。用SYBR Green Ⅰ染料法进行RT-PCR反应，检测RANKL、OPG的mRNA相对表达水平，内参为GAPDH。同时收集细胞上清液，按ELISA试剂盒操作步骤检测RANKL、OPG的蛋白表达水平。根据所测数据计算RANKL/OPG的比值。

表1 RT-PCR引物序列

2 结 果

2.1 HPDLF的培养与鉴定 组织块培养8～10 d时，镜下见其周边有游出的细胞，呈高折光率的长梭形(图1A)。10～14 d后，大量成纤维细胞游出，向四周呈放射状生长(图1B)。高倍镜下细胞呈长梭形，细胞核呈椭圆形或圆形，细胞体丰满，细胞质均匀，折光性强。细胞经免疫细胞化学染色后，细胞波形丝蛋白染色呈阳性(图2A)，角蛋白染色呈阴性(图2B)，表明所取细胞为中胚层来源，并且没有被外胚层来源的细胞污染。根据细胞长梭形的形态及牙周的取材部位，可判定所用细胞为HPDLF。

2.2 IL-17对HPDLF增殖活性的影响 MTT结果显示，细胞在0～40 ng/mL的IL-17刺激24 h后，OD值持续升高，HPDLF增殖能力逐渐增强，在40 ng/mL组达到高峰(P<0.01)。60～80 ng/mL组中OD值逐渐下降，HPDLF增殖变缓并逐渐下降(P<0.01)，其增殖活性被抑制(图3)。因而选择0～40 ng/mL的IL-17用于实验。

A:原代培养8 d;B:原代培养14 d

图1 细胞形态(普通光学显微镜×100)

A:波形丝蛋白染色阳性;B:角蛋白染色阴性

图2 波形丝蛋白及角蛋白抗体染色(×100)

图3 IL-17对HPDLF增殖的影响

2.3 HPDLF的RANKL表达 在对照组(0 ng/mL)中，RANKL的mRNA和蛋白都存在表达。不同水平的IL-17作用于HPDLF 24 h后，各实验组(5、10、20、40 ng/mL组)RANKL的mRNA相对表达量均比对照组显著上调，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。0～20 ng/mL各组，RANKL的mRNA表达量随着IL-17水平的增大而增大，在20 ng/mL组达最高水平，在40 ng/mL组开始下降(图4A)。各实验组中RANKL的蛋白表达量均比对照组显著上调(P<0.05，P<0.01)。0～40 ng/mL各组，RANKL的蛋白表达量随着IL-17水平的增大而增大，在40 ng/mL组达最高水平(图4B)。

2.4 HPDLF的OPG表达 在对照组(0 ng/mL组)中，OPG的mRNA和蛋白都存在表达。与对照组(0 ng/mL组)比较，除5 ng/mL组，其余各组OPG的mRNA表达均下调(P<0.05)。5～20 ng/mL组中，OPG的mRNA表达量随着IL-17水平的增大而下降，20 ng/mL组表达量最小，40 ng/mL组开始上升(图5A)。各实验组中OPG的蛋白表达量均比对照组显著下调(P<0.05)。0～20 ng/mL各组，OPG蛋白的表达量随着IL-17水平的增大而减小，在20 ng/mL组达最低，在40 ng/mL组开始上升(图5B)。

2.5 RANKL/OPG的比值 各实验组RANKL/OPG的mRNA、蛋白的比值均比对照组显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。0～20 ng/mL各组，RANKL/OPG的mRNA、蛋白比值随着IL-17水平的增大而增大，在20 ng/mL组达最高水平，在40 ng/mL组开始下降，见图6。

A:RANKL mRNA；B：RANKL蛋白；a：P<0.05;b:P<0.01

图4 RANKL mRNA及蛋白表达

A:OPG mRNA;B:OPG 蛋白；a：P<0.05;b:P<0.01

图5 OPG mRNA及蛋白表达

A:RANKL/OPG的mRNA比值;B:RANKL/OPG的蛋白比值；a：P<0.05;b:P<0.01

图6 RANKL/OPG mRNA及蛋白表达

3 讨 论

RANKL为Ⅱ型跨膜蛋白，与细胞核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)结合后，能直接启动破骨细胞前体和破骨细胞的胞内信号转导，通过一系列酶促级联反应引起破骨细胞前体分化、增殖和成熟，并激活破骨细胞从骨膜中释放、转移、黏附到骨质表面，从而引起骨吸收。而OPG是一种分泌性糖蛋白，通过与RANKL特异性结合，起到竞争性抑制RANK与RANKL结合的作用，从而抑制破骨细胞分化成熟，并诱导破骨细胞凋亡[6]。其中由破骨细胞介导的骨吸收程度常以RANKL/OPG的比值来衡量[7]。HPDLF是牙周膜中最主要的细胞之一，其功能和代谢受多种细胞因子调节和影响，也能通过表达多种细胞因子影响骨代谢活动。研究表明，HPDLF可以通过表达RANKL和OPG来影响破牙骨质细胞的活动，并调节牙根吸收过程[8-9]。

正畸相关炎性牙根吸收的重要原因之一是正畸牙移动所致的炎性反应。而IL-17作为一种重要的促炎性细胞因子，与其他已知的白细胞介素和蛋白的结构不相似，拥有独特的结构，具有强大的促炎症作用和骨吸收作用[10-11]。本课题组前期实验显示，静压力能刺激HPDLF产生IL-17等促炎因子。其中动物实验显示，牙周膜注射外源性IL-17能上调RANKL的表达，加重正畸牙根吸收的范围和严重程度；而外源性IL-17抗体下调RANKL的表达，减轻正畸牙根吸收。这提示，IL-17可能通过调节HPDLF中的RANKL参与正畸相关炎性牙根吸收。

为证实推断，本研究采用组织块培养法，在体外建立人HPDLF系。以不同水平的IL-17刺激HPDLF，作用24 h后，检测RANKL和OPG的表达情况。实验结果显示，在0 ng/mL组中HPDLF能表达RANKL和OPG，说明在无IL-17刺激时，RANKL和OPG均能表达于HPDLF。与对照组(0 ng/mL组)比较，IL-17作用于HPDLF后，RANKL的mRNA、蛋白表达量均增加；OPG的mRNA、蛋白表达量均减小；RANKL/OPG的mRNA、蛋白的比值均增大。可以得出，IL-17可促进HPDLF中RANKL的表达，抑制OPG的表达。Ogasawara等[12]报道的在大鼠实验性正畸牙移动中，成骨细胞和牙周膜细胞均存在RANKL和OPG的表达；Kanzaki等[13]研究发现HPDLF是通过上调RANKL和抑制OPG的表达，调节破骨细胞进行骨吸收，均与本实验结果相符。

RANKL的mRNA、蛋白表达量随着IL-17水平的增加而增大，OPG的mRNA、蛋白表达量随着IL-17水平的增加而下降。说明IL-17对HPDLF中RANKL、OPG细胞因子的调节存在一定的浓度依赖性，与林丹萍等[14]的研究发现相符，即IL-17可提高人HPDLF中RANKL的表达水平，并随着IL-17水平增高和刺激时间延长而增加。RANKL/OPG的比值是衡量由破骨细胞介导的骨吸收程度的指标。本实验结果显示，在0～40 ng/mL各组中IL-17能通过上调RANKL和下调OPG，从而上调RANKL/OPG的比值。其中，20 ng/mL组RANKL/OPG的比值最大，受到的影响最为明显。这提示IL-17调节RANKL/OPG骨代谢系统的体外理想水平是20 ng/mL。为下一步研究IL-17作用时间对RANKL、OPG表达的影响，提供了适宜的刺激水平。

综上所述，在HPDLF中，IL-17主要通过促进RANKL和抑制OPG等骨吸收相关因子的表达，介导破骨细胞的分化与成熟，进而参与正畸相关性牙根吸收。且IL-17对HPDLF中RANKL、OPG因子的调节存在浓度依赖性。牙周膜成纤维细胞RANKL和OPG之间的平衡可受外界因素干扰，因而外源性因素可干预正畸牙根吸收过程中的牙周组织代谢活动，即通过调节RANKL、OPG的表达参与牙槽骨的改建。但破骨细胞的形成是受多因素调节的，IL-17与RANKL、OPG之间的具体作用机制仍然需要未来更多实验去研究及验证。

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Effects of different concentration of IL-17 on the expression of RANKL and OPG in human periodontal ligament fibroblasts*

LiLinjuan,LiMin,PengJuanmin,KangNa△

(DepartmentofOrthodontics,AffiliatedStomatologicalHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

Objective To study the effects of different concentration of interleukin(IL)-17 on the expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) and osteoprogeterin (OPG) in human periodontal ligament fibroblasts (HPDLF) and explore the relationship between IL-17 and orthodontic root resorption.Methods HPDLF cell line was established through the tissue pieces culture method in vitro.HPDLF were stimulated by IL-17 with five different concentrations(0,5,10,20,40 ng/mL) for 24 h.The expression level of mRNA and protein of RANKL and OPG in HPDLF were detected by RT-PCR and ELISA,respectively.Results HPDLF expressed RANKL and OPG in 0 ng/mL group.The expression amount of mRNA and protein of RANKL in HPDLF was positive correlation with the concentration of IL-17 in 0 to 20 ng/mL group.The expression amount of mRNA and protein of OPG was negative correlation with the concentration of IL-17 in 5 to 20 ng/mL group.The ralative RANKL/OPG ratio of mRNA and protein were positive correlation with the concentration of IL-17 in 0 to 20 ng/mL group.Conclusion HPDLF expresses RANKL and OPG in the absence of IL-17.IL-17 enhances the expression of RANKL and inhibits the expression of OPG in HPDLF.

periodontal ligament;fibroblasts；IL-17；RANK ligand；osteoprotegerin

国家自然科学基金资助项目(81360170)。

李琳娟(1990-)，硕士，主要从事口腔正畸研究。

△通信作者，E-mail:kangna78@126.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.003

R783.5

A

1671-8348(2017)23-3177-03

2017-03-19

2017-04-21)

论著·基础研究