猪伪狂犬病病毒野毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

常 晨，张道华*，唐 波，刘国阳，华 涛，侯继波

(1.江苏省农业科学院 动物免疫工程研究所，江苏 南京 210014； 2.江苏省农业科学院 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014； 3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

猪伪狂犬病病毒野毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

常 晨1，2，3，张道华1，2，3*，唐 波1，2，3，刘国阳1，2，3，华 涛1，2，3，侯继波1，2，3

(1.江苏省农业科学院 动物免疫工程研究所，江苏 南京 210014； 2.江苏省农业科学院 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014； 3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

根据猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因序列，设计一对特异性引物，建立了鉴别PRV野毒感染的荧光定量PCR方法。该方法灵敏度达到102拷贝/μL，与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙脑病毒(JEV)不发生交叉反应，具有良好的特异性和重复性；用PRV强毒攻毒仔猪，荧光定量PCR比普通PCR能更灵敏检出组织带毒量。该方法可以用于猪的组织样品，如脑、肺、扁桃体、淋巴结等样品中伪狂犬野毒的定量，可用于临床伪狂犬野毒感染的早期检测和定量分析猪伪狂犬病毒感染程度。

猪伪狂犬病病毒；SYBR- GreenⅠ；荧光定量PCR；野毒；检测

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的危害多种动物的一种以发热、奇痒(猪除外)和以脑脊髓炎为代表的神经症状的急性传染病。猪是PRV的主要贮存宿主及疫源动物。猪伪狂犬病常引起妊娠母猪繁殖功能障碍和初生仔猪的神经症状，仔猪感染率和死亡率极高，给世界养猪业带来巨大的损失[1-2]。猪伪狂犬病具有潜伏感染的特点，病毒可在耐过感染的猪体内终生潜伏，在一定条件下，病毒可能被激活，导致猪群复发感染，及时诊断是预防和控制该病的关键[1-3]。过去诊断猪伪狂犬病的方法有病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验、中和试验、常规PCR检测等等，但是过程繁琐、周期长，还存在污染和特异性差的缺点，给该病的临床检测和防治带来滞后性[4]。荧光定量PCR技术是在PCR 技术基础上发展起来的一种新型检测技术，SYBR-GreenⅠ荧光信号的积累与扩增的双链DNA数量呈正相关。该方法操作简便、敏感度高、成本较探针低，可以达到快速、定量的目的，在动物疾病早期诊断和疫苗效果评价中有重要意义。

gI基因和gE基因是伪狂犬病毒毒力基因，以gI/gE基因序列作为靶序列建立的PCR技术，能够区分基因缺失疫苗接种和野毒感染。本研究设计一对引物，利用SYBR-GreenⅠ荧光染料定量PCR方法，可以定量检测出组织中的病毒含量，对诊断伪狂犬病毒早期感染和净化病毒有重要意义。

1 材料与方法

1.1 毒株与菌种

PRV NJ株为本实验室分离与保存，DH5a工程感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

Taq DNA聚合酶、DL5000 Marker、SYBR Premix Ex TaqTM、pMD18-T载体、质粒DNA小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪购自美国Gene公司。

1.3 质粒模板标准品的制备

以伪狂犬病毒DNA为模板，PCR获得848 bp的伪狂犬gI/gE基因片段，引物序列(实验室保存)如下：gI/gE基因上游引物：5′-CCCTGGACGCGAACGGCACGATG-3′；下游引物：5′-GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA-3′。PCR运行程序如下：94 ℃，5min；94 ℃，1 min；68 ℃，1 min；72 ℃，1 min；34个循环；72 ℃，10 min。1%琼脂糖凝胶电泳，目的片段胶用回收试剂盒回收，按照载体连接试剂盒将基因片段连接pMD-18T载体，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性菌落，提取质粒，酶切鉴定，将阳性结果的菌液送英骏公司测序。经测序验证的阳性质粒作为DNA标准品，命名为pMD-PRV-gI/gE。将标准质粒进行10倍系列稀释至浓度为108～104copies/μL，用于建立标准曲线。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank登录的伪狂犬病毒gI/gE基因序列，应用Primer Premier 5.0生物软件设计出扩增110 bp片段的1对特异性引物，送大连宝生物工程有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5′-GGTGTTTGCATAATTTTGTGGGTGG-3′；下游引物：5′-GAAAGGGCCGCATGGTCTCA -3′。

1.5 SYBR -GreenⅠ荧光定量PCR 扩增及标准曲线的建立

用紫外分光光度计测量质粒标准品pMD-PRV-gI/gE的OD值，计算拷贝数，以10倍梯度稀释质粒为模板进行荧光定量PCR 扩增，得到动力学曲线及标准曲线。在20 μL反应体系中依次加入以下成分：上、下游引物各0.4 μL， SYBR GreenⅠ Pre Mix聚合酶10 μL，模板2 μL，灭菌去离子水7.2 μL。在避光条件下将上述反应体系混匀后进行荧光定量PCR 扩增，反应的循环参数为：95 ℃，5 min；95 ℃，5 s；60 ℃，20 s；40个循环。

1.6 特异性检验

将JEV、CSFV的病毒液按RNA iso Reagent试剂盒(Trizol法)提取总RNA，再反转录为cDNA 。按照蛋白酶K方法提取PRV、PPV、PCV - 2的DNA，备用。按照SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应体系取5管，分别加入PRV DNA 2 μL(约100 ng)，PPV DNA 2 μL(约100 ng)，PCV - 2 DNA 2 μL(约100 ng)，CSFV cDNA 2 μL(约100 ng)，JEV cDNA 2 μL(约100 ng)；同时设阴性对照，验证其特异性。

1.7 重复性检验

选取伪狂犬病毒同一浓度的质粒标准品进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 反应，每一样品做3个重复，通过Ct值和溶解曲线峰值温度的分析，验证PRV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的稳定性。

1.8 敏感性测定

将已计算出拷贝数的含目的基因的质粒做10倍梯度稀释，稀释为109～100copies/μL，作为模板进行荧光定量PCR，以此计算出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数。

2 结果与分析

2.1 PRVgI/gE基因PCR扩增与测序

取PCR产物5 μL于1%琼脂糖凝胶上电泳，扩增产物在750 bp与1000 bp之间，与预计的片段大小相符(图1)。PCR产物经胶回收纯化后，与pMD 18-T载体连接并转化DH5a感受态细胞。提取质粒，进行酶切鉴定。将酶切大小正确的重组质粒送英骏公司测序，测定结果与目的序列完全一致。

2.2 标准曲线的建立

使用TaKaRa推荐的2步法将60 ℃作为退火温度，扩增动力学曲线良好，并且所对应的熔解曲线无非特异性扩增出现。使用TaKaRa推荐的Roche LightCycler反应体系，终浓度为0.2 μmol/L的引物扩增动力学曲线良好(图2)，并且所对应的熔解曲线无非特异性扩增出现。将重组质粒进行10倍梯度倍比稀释，选取合适浓度范围(104～108拷贝/μL)，进行Real-time PCR，通过LightCycler 480 software release 1.5.0 SP3软件进行数据分析。获得PRVgI/gE基因标准曲线，如图3所示，标准曲线的截距为43.01，斜率为-3.301，扩增效率为100.009%，误差为0.00969，判定系数R2为0.99。

2.3 荧光定量PCR扩增的可重复性

为验证荧光定量PCR检测结果的可重复性，将重组质粒每个稀释度做3个重复，由图4可知，3次的动力学曲线重合，可见荧光定量PCR有很高的可重复性。

曲线1、2、3、4、5的质粒的浓度分别为

图3 gI/gE基因标准曲线

2.4 荧光定量PCR扩增的特异性

对PRV、JEV、CSFV、PPV、PCV-2及双蒸水进行荧光定量PCR检测，结果(图5)显示gI/gE荧光定量PCR对伪狂犬病毒NJ株在10个循环左右开始起峰，而对JEV、CSFV、PPV、PCV-2及双蒸水均在30个循环左右起峰，用于检测的引物具有高度的特异性。

2.5 荧光定量PCR扩增的敏感性

以10倍梯度稀释的gI/gE标准质粒为模板，用所建立的荧光定量PCR进行检测。如图6所示，发现稀释至102拷贝/μL时，仍有规律的S型荧光曲线。

图5 荧光定量PCR特异性扩增结果

2.6 对免疫攻毒猪病料的检测

为了验证建立的荧光定量PCR方法对伪狂犬病毒感染的检出结果，我们用伪狂犬灭活苗免疫试验猪10头，同时设空白猪2头，2周后攻毒，5 d后扑杀，根据鼻拭子排毒情况，分别取免疫组和对照组排毒最严重的3头猪的脑、肺、扁桃体、脾、淋巴结组织，研磨，提取组织DNA，同时采用本法和普通PCR进行检测。结果见表1和表2，用本法检测攻毒保护猪的脑、扁桃体、淋巴结中伪狂犬病毒结果均为阳性，其中扁桃体中的病毒含量最高；PCR检测仅部分结果呈阳性。

曲线1、2、3、4、5、6、7、8的质粒浓度分别为109、108、107、106、105、104、103、102拷贝/μL。

3 讨论

猪伪狂犬病作为危害我国养猪业的一个重要传染病，加上近年来许多大规模的伪狂犬疫情在猪场暴发，临床快速、准确诊断伪狂犬病，对该病的发现和防控有重要意义。猪急性感染后，伪狂犬病毒能够在神经系统中建立终身潜伏感染[5-7]。PRV疫情诊断有3个时间段难以检测出猪体内的病毒：(1)急性感染期～血清转阳之前；(2)恢复期；(3)潜伏期。过去使用市售的gB阻断ELISA和gE阻断ELISA来检测恢复期的PRV特异性抗体，以此区分野生型伪狂犬病毒和接种的疫苗毒株，但其不能诊断伪狂犬病毒的急性感染，并且在某些猪中，潜伏期的抗体水平存在衰减，容易产生假阴性结果[5]。因此，有效检测潜伏感染的猪是控制和根除伪狂犬病的关键。PCR技术能快速、敏感和准确地诊断猪的伪狂犬病[8,10]。另一项研究报道，实时荧光定量PCR比普通PCR检测更敏感[11-12]，本研究证实了这一结果。常规PCR方法无法作出早期的诊断；本方法不仅呈现良好的特异性，检测灵敏度可以达到102拷贝/μL，与常规的PCR方法比较，该方法更精确，更省时，操作更简便。张雪寒等[12]利用TaqMan探针技术建立检测猪伪狂犬病毒的方法，可检测到20拷贝/μL，但其成本高，需结合特异性探针。本试验建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，选取猪伪狂犬病毒gI、gE基因的重组质粒作为标准品，建立标准曲线，该方法呈现良好的S型扩增曲线，具有很好的重复性，能够灵敏地检测出猪伪狂犬病野毒感染的情况。

表1 免疫后攻毒猪样品荧光定量PCR检测结果

注：“-”代表结果阴性；CT值表示阳性样品检出时对应的循环数。

表2 免疫后攻毒猪样品PCR检测结果

注：“+”代表结果阳性；“-”代表结果阴性。

为了更好验证本研究建立的定量PCR方法的可操作性，我们选取了攻毒保护实验中鼻拭子排毒最多的3头猪，取脑等组织研磨，提取DNA，分别进行普通PCR检测和荧光定量PCR检测。普通PCR阳性的样品，本法同样得到阳性的结果。本法检测组织样品中病毒载量均大于350拷贝/μL。

本试验建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，可作为规模化猪场PRV的净化检测方法，建立无PRV的猪群，同时也为伪狂犬病毒的早期诊治建立了基础。

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(责任编辑：许晶晶)

Establishment of SYBR-Green Ⅰ Real-time Quantitative PCR Method for Detection of Porcine Pseudorabies Wild-type Virus

CHANG Chen1，2，3, ZHANG Dao-hua1，2，3*, TANG Bo1，2，3, LIU Guo-yang1，2，3, HUA Tao1，2，3, HOU Ji-bo1，2，3

(1. Institute of Veterinary Immunology and Engineering, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biological Products, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

We designed a pair of specific primers according to the sequence of genegI/gEin porcine pseudorabies virus (PRV), and established the SYBR-Green Ⅰ real-time quantitative PCR method for the detection of wild-type PRV. The sensitivity of this method reached 100 copy/μL. This method exhibited good specificity and repeatability, and it could prevent from the cross reactions between PRV and other porcine pathogens such as PCV2, PPV, CSFV and JEV. After piglets were challenged with high-virulent PRV, the virus in pig tissue could be detected more sensitively by fluorescent quantitative real-time PCR than by traditional PCR. This method can be used for the quantitative assay of wild-type PRV in the tissue (such as brain, lung, tonsil and lymph nodes) samples of pig, and it also can be used for the early clinical detection of wild-type PRV and the quantitative analysis of the infectious degree of PRV.

Porcine pseudorabies virus; SYBR-Green Ⅰ; Real-time quantitative PCR; Wild-type virus; Detection

2017-05-27

农业公益性行业科研专项经费项目(201303046)。

常晨(1987─)，女，江苏南京人，助理研究员，硕士，主要从事动物疫苗产品研究工作。*通讯作者：张道华。

S858.28

A

1001-8581(2017)09-0001-04