微流体装置线性去除猪MII期卵母细胞冷冻保护剂的实验研究

周新丽 杨 云 戴建军 张德福 邵文琪 衣星越 陶乐仁

1(上海理工大学生物热科学研究所，上海 200093)2(上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106)

微流体装置线性去除猪MII期卵母细胞冷冻保护剂的实验研究

周新丽1*杨 云1戴建军2张德福2邵文琪1衣星越1陶乐仁1

1(上海理工大学生物热科学研究所，上海 200093)2(上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106)

低温保存后的卵母细胞在使用前必须要去除冷冻保护剂，目前常用的分步法去除步骤繁琐，容易丢失细胞，而且会对细胞造成致命的渗透损伤。为减小细胞渗透损伤，设计制作适合卵母细胞保护剂去除的微流体装置，研究微流控线性法去除猪MII期卵母细胞低温保护剂时在不同时间(6、8、10 min)下卵母细胞的体积变化，以及对卵母细胞存活率与发育率的影响；并与传统的去除方法(一步法和分步法)进行比较。结果表明，采用微流体装置线性去除冷冻保护剂，8 min为实验中的最优去除时间；线性法能够明显减小细胞的渗透损伤，其最大归一化渗透膨胀体积为1.12±0.07，卵母细胞的存活率、卵裂率及囊胚率分别达到83.6%、72.4%、21.5%，均显著高于一步法和分步法(P<0.05)。因此，微流控线性去除冷冻保护剂能够显著减小细胞的渗透损伤，为卵母细胞低温保存技术提供新思路。

微流体；混合；卵母细胞；冷冻保护剂；渗透损伤

引言

卵母细胞的低温保存在人类的辅助生殖领域及优良品种畜禽种质资源的保存方面都具有重要的意义[1-2]。在细胞低温保存过程中，需要添加冷冻保护剂来抑制冰晶对细胞的损伤[3]。然而，由于保护剂自身具有化学毒性，复温后的细胞不能直接使用，必须要将保护剂稀释或去除。冷冻保护剂的去除过程与加载过程一样，由于胞内外渗透压的变化，大量的水或保护剂会快速流入或流出细胞，从而引起细胞体积的剧烈变化，对细胞造成明显的渗透损伤[4-6]。目前，研究者对冷冻保护剂的加载过程已经做了大量的优化研究，包括保护剂浓度、添加步骤、每一步的平衡时间、温度等[7-9]。与加载过程相比，去除过程的研究就显得薄弱很多。Liu等和Coticchio等模拟发现，冷冻保护剂的去除过程对细胞的渗透损伤要远大于其他步骤，缩短冷冻保护剂的去除程序可能会减少细胞的渗透损伤[10-11]。因此，有必要对细胞冷冻保护剂的去除方法进行改进，从而进一步提高其低温保存的效果。

近年来，为减小保护剂去除过程对细胞的渗透损伤，提高细胞冷冻保护剂的去除效率，研究学者也提出了一些新方法。张晓光等采用透析法来去除红细胞渗透性低温保护剂(甘油)，结果表明该方法能够快速有效地去除红细胞内的低温保护剂，去除后红细胞的回收率为(89.17±2.46)%，血红蛋白回收率为(84.93±4.64)%，细胞悬浮液的渗透压(残留甘油的含量)为(340.33±20.56)mOsm[12]。Mata等和Hanna等[15]提出采用微流体装置去除脐带血低温保护剂，分别制作了水平两流和垂直三流的微流体装置，验证了微流体装置去除冷冻保护剂的效率[13-15]。结果表明，微流体装置能够通过扩散作用实现保护剂的去除，但是要达到较大处理量和95%以上的去除率则需要采用多级串联的方式。与传统的离心去除法相比，这些方法明显减小了细胞的丢失率，改善了胞内保护剂的去除效率，但仅适用于处理大量的小体积细胞，对于卵母细胞并不适合。因为卵母细胞体积较大，直径大于100 μm，在临床上多以单个细胞操作。目前，对于卵母细胞冷冻保护剂，通常采用分步去除的方法。尽管分步法对细胞的损伤小于一步法，但是分步法的实际操作程序比较繁琐，同时细胞在不同的溶液间不断转移，容易造成细胞丢失，而且细胞仍然会经历多次的体积骤变[16]。关于微流体装置用于卵母细胞冷冻保护剂去除，这类的相关研究还未见报道。

笔者设计制作了一个特殊的微流体装置，用于猪MII期卵母细胞冷冻保护剂(Me2SO)的去除研究。首先，对微流体线性法去除时间进行优化，分析了不同去除时间(6、8、10 min)下卵母细胞的体积变化，以及对卵母细胞存活率与发育率的影响；然后，比较了不同去除方式(一步法、两步法、三步法、微流体线性法)下卵母细胞的体积变化，以及对卵母细胞存活率与发育率的影响，确定微流体装置用于卵母细胞冷冻保护剂去除的有效性，以期为卵母细胞保护剂去除方案的设计和优化提供指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

组织培养液(tissue culture medium 199, TCM199)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)、二甲基亚砜(Me2SO)、蔗糖、山梨醇、醋酸钙、醋酸镁，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司，美国。实验中所用其他试剂除特别说明外，均购自美国Sigma公司。

1.2 玻璃化冷冻/解冻液

实验中所用溶液的温度为37℃，浓度为体积比浓度。基础液：TCM199+20% FBS。玻璃化冷冻液：(VS1)基础液+15% Me2SO；(VS2)基础液+30% Me2SO。一步法解冻液：基础液。两步法解冻液：(WS1)基础液+1 mol·L-1蔗糖，(WS2)基础液。三步法解冻液：(WS1)基础液+1 mol·L-1蔗糖，(WS2)基础液+0.5 mol·L-1蔗糖，(WS3)基础液。微流控线性法解冻液：基础液+1 mol·L-1蔗糖。

1.3 猪卵母细胞的采集及MII期卵母细胞的获得

从上海市嘉定区某屠宰场采集新鲜猪卵巢组织，放在37℃含1 000 μg/mL的双抗生理盐水中，1 h内运回实验室。用生理盐水冲洗2～3次，选择卵巢表面直径为2～ 6 mm的卵泡，用10 mL的一次性注射器将卵母细胞复合体连同卵泡液一起吸出。将抽出的液体置于10 mL的离心管中，在39.5℃的恒温水浴中静置15～20 min，移除上清液。 取胞质均匀且有3层以上致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体，即GV期卵母细胞。将GV期卵母细胞洗涤3次后，置于已平衡4 h以上的成熟培养液中，培养液为TCM199+10% FBS+10% 猪卵泡液+0.1% 血清促性腺激素(PMSG)+ 0.1% 人绒毛膜促性腺激素(hCG)，然后再放入CO2培养箱((39±0.5)℃、5% CO2，BC-J160S，上海博讯实业有限公司，中国)中，成熟培养44 ～ 46 h，得到MII期卵母细胞。 MII期卵母细胞用0.1%透明质酸酶消化，以去除卵丘细胞，再用TCM199洗涤3 ～ 5次备用。

1.4 微流体芯片的设计与制作

用于卵母细胞冷冻保护剂去除的微流体芯片如图1(a)所示，主要包括流体混合通道、细胞分析腔、细胞出入通道等。蛇形混合通道的尺寸为长100 mm×宽150 μm×高150 μm，解冻液和基础液在通道内层流扩散混合，实现解冻液浓度的连续线性变化。细胞分析腔的尺寸为长1 200 μm×宽1 000 μm×高150 μm，卵母细胞经细胞通道导入细胞分析腔。为了防止卵母细胞被流体冲走，在细胞分析腔的内部加工了两排直径为100 μm的柱状障碍物，障碍物之间的间距为50 μm，如图1(b)所示。

图1 用于卵母细胞冷冻保护剂去除的微流体装置结构。(a)微流体芯片；(b)细胞分析腔Fig.1 The structure diagrams of microfluidic chip used oocyte unloading for CPA. (a)Microfluidic chip; (b)Oocyte analysis chamber

微流体芯片是通过模塑法来制作的。首先在硅晶片上利用光刻胶得到微流控芯片结构的光刻模具，再将PDMS和固化剂混合均匀并浇注在模具上，等完全固化后将PDMS材料从模具上剥落下来，得到刻有微通道的微流控芯片基片；将PDMS基片和PDMS盖片对齐符合完成封接，然后放在75℃的烘箱中加热10 min，得到牢固的PDMS芯片；最后在芯片的制定位置处用钻孔器打4个直径为0.6 mm的孔，用塑料管连接注射泵和口吸器，使流体和细胞顺利进出微流体芯片。

1.5 用于卵母细胞冷冻保护剂连续去除的微流控实验系统

图2是实现卵母细胞冷冻保护剂连续去除的实验系统，主要由微量注射泵(Pump 11 Plus微量注射泵，Harvard，美国)、微量进样器(1 mL微量进样器，上海高鸽工贸有限公司，中国)、倒置荧光显微镜(TS100倒置荧光显微镜，Nikon，日本)、微流体芯片以及废液瓶等组成。在导入卵母细胞之前，先将1 mol·L-1的蔗糖溶液充满混合通道，然后将加载过Me2SO的卵母细胞吹进细胞分析腔内并开启注射泵，通过注射泵分别将解冻液和基础液注入微流体芯片内。由于蔗糖溶液的黏度较大，为保证溶液在微通道内顺畅流动，并实现解冻液浓度的线性变化，实验中选择混合通道内溶液的总流量为5 μL/min，即控制基础液的流量从0 μL/min增加到5 μL/min，同时解冻液的流量从5 μL/min减小到0 μL/min，去除时间为8 min。在去除过程中，连续记录细胞体积的变化。去除结束后，将卵母细胞从细胞腔内吸出，进行细胞存活率及发育率的实验。

图2 微流体装置用于冷冻保护剂去除的系统Fig.2 The system diagram of CPA unloading with microfluidic device

1.6 实验设计

为了研究冷冻保护剂去除过程对猪MII期卵母细胞渗透损伤的影响，以下两组实验中冷冻保护剂(30% (V/V) Me2SO)的加载都采用相同的方法——两步法，就是将卵母细胞从基础液中转移至15% (V/V) Me2SO中平衡3 min，然后移至30% (V/V) Me2SO中平衡30 s，完成冷冻保护剂的加载，备用。

实验1：对微流控线性法去除冷冻保护剂的时间进行优化，通过注射泵控制流体流量，使腔体内胞外解冻液的浓度分别在6、8、10 min内，从1 mol·L-1线性减小到0 mol·L-1，具体的去除程序如图3(a)所示。

图3 实验方案。(a)不同时间的线性法去除方案;(b)4种不同的保护剂去除方式Fig.3 Experiment protocols in this study. (a) Linear protocols to different unloading duration; (b) Four different CPA unloading protocols

实验2：采用一步法、两步法、三步法、线性法4种不同的方式去除卵母细胞冷冻保护剂，具体的去除程序和去除时间如图3(b)所示。一步法：将卵母细胞直接转移至基础液中平衡8 min。两步法：将卵母细胞移至1 mol·L-1蔗糖溶液中平衡2 min，然后移至基础液中平衡6 min。三步法：将卵母细胞移至1 mol·L-1蔗糖溶液中平衡2 min，再移至0.5 mol·L-1蔗糖溶液中平衡3 min，然后转移至基础液中平衡3 min。线性法：将卵母细胞导入细胞分析腔内，控制胞外解冻液浓度从1 mol·L-1线性减小到0 mol·L-1，去除时间设定为8 min。

1.7 细胞图像采集与数据处理

在冷冻保护剂去除过程中，用带有图像采集系统的显微镜连续记录并获取整个过程中细胞(n=5)的体积变化图片。假设卵母细胞为理想球体，利用图像分析软件测量细胞的二维投影面积，再通过球体体积与投影面积的换算关系式(V=0.752S3/2)，计算得到细胞的体积变化。

1.8 细胞存活率与发育率判断

按照实验中设计的方案去除冷冻保护剂后，将卵母细胞转移至培养液中，放入CO2培养箱孵育1 h，然后将一部分细胞用荧光素双醋酸酯(fluorescein diacetate, FDA)染色5 min，再用TCM199洗3～5遍，在倒置荧光显微镜下观察是否着色。有强荧光反应的为活卵，无荧光反应或弱荧光反应的为死卵。活卵数与细胞总数之比为存活率。将另一部分细胞进行孤雌激活，激活后的细胞转移至胚胎培养液中，然后放入CO2培养箱培养。分别在培养的第2、7天观察细胞卵裂率和囊胚率。

1.9 数据分析

每组实验至少重复3次，试验数据采用Mean±SD表示，并用SPSS Statistics 13.0 软件进行显著性分析，P<0.05为显著性差异标准。

2 结果

2.1 不同去除时间下卵母细胞体积变化

图4 微流控线性法不同去除时间下MII期猪卵母细胞的体积变化Fig.4 Volumetric responses of MII porcine oocyte to different unloading duration with linear method

图4表示微流控线性法不同去除时间下卵母细胞的体积变化。可以看出，在采用3种不同的去除时间时(6、8、10 min)，细胞体积都呈现先增大后减小的变化趋势，其中最大归一化渗透膨胀体积依次分别为1.18±0.02、1.12±0.07、1.07±0.01。当细胞达到渗透平衡时，6和8 min处理后细胞的体积基本能够恢复到初始体积。然而，对于10 min去除方案来说，从150 s之后细胞体积开始突然减小，其最终归一化体积为0.87±0.03。因此，8 min去除时细胞体积的改变量较小，细胞受到的渗透损伤较小，该时间为实验中的最佳去除时间。2.2 不同去除时间对卵母细胞存活率与发育率的影响

表1呈现了微流控线性法不同去除时间对卵母细胞存活率与发育潜能的影响。可以看出，线性法处理后细胞的存活率和发育潜能都显著低于新鲜组，说明该方法仍会对细胞造成一定的损伤。8 min去除方案下细胞的存活率和卵裂率分别为88.7%、72.5%，都显著高于另外两种去除方案(6和10 min)。然而，8 min去除方案下卵母细胞的囊胚率为21.5%，略高于6 min(20.2%)和10 min(18.4%)，但三者之间并无显著性差异。

表1 微流控线性法不同去除时间对MII期猪卵母细胞存活率与发育率的影响

Tab.1 Effects of the different unloading durations with microfluidics on the survival rate and development rate in vitro of MII porcine oocytes

组别存活率/%卵裂率/%囊胚率/%对照组(n=127)97.7±4.2a85.4±3.4a30.7±6.1a6min(n=121)72.9±0.5b64.6±0.4b20.2±1.8b8min(n=118)88.7±6.8c72.5±3.9c21.5±3.7b10min(n=88)79.5±2.2d54.4±6.2d18.4±9.4b

注：不同字母表示组之间有显著性差异，P<0.05。

Note: Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

图5 4种不同去除方式下猪MII期卵母细胞的体积变化Fig.5 Volumetric responses of MII porcine oocyte under four different CPA unloading protocols

2.3 不同去除方式下卵母细胞的体积变化

图5表示采用不同的方式去除胞内保护剂Me2SO时卵母细胞的体积变化。可以看出，用一步法、两步法、三步法和线性法去除冷冻保护剂时，细胞体积都呈现先增大后逐渐减小的变化趋势。采用一步法去除保护剂时，卵母细胞的归一化最大渗透体积达到了1.92±0.04，同时，当细胞达到渗透平衡时，其体积也不能恢复到初始体积。与一步法相比，分步法和线性法去除冷冻保护剂时，卵母细胞体积的膨胀程度明显减小，细胞的最大归一化渗透体积分别为1.33±0.05、1.12±0.07。线性法去除冷冻保护剂时，细胞体积的变化曲线更平缓，说明微流体法对细胞的渗透损伤要小于一步法和分步法。2.4 不同去除方式对卵母细胞存活率与发育率的影响

为了探究微流体法用于卵母细胞冷冻保护剂去除的有效性，比较了一步法、两步法、三步法及线性法4种不同的去除方式对猪MII期卵母细胞存活率和发育潜能的影响，结果见表2。两步法和三步法去除保护剂时卵母细胞的存活率、卵裂率、囊胚率分别为(62.5%、48.6%、10.3%)和(71.4%、50.3%、12.7%)，都显著高于一步法(15.2%、0、0)。然而，两步法和三步法在卵母细胞的发育率方面无显著性差异，说明分步步数的增加并不能改善细胞的发育率。采用线性法去除冷冻保护剂后，卵母细胞的存活率、卵裂率及囊胚率分别为83.6%、72.4%、21.5%，均显著高于一步法和分步法，说明线性法对细胞的渗透损伤最小，用于卵母细胞冷冻保护剂的去除是有效的。

表2 冷冻保护剂不同去除方式对MII期猪卵母细胞存活率与发育率的影响

Tab.2 Effects of different CPA unloading protocols on the survival rate and development rate in vitro of MII porcine oocytes

组别存活率/%卵裂率/%囊胚率/%对照组(n=176)(96.8±2.1)a(85.8±1.0)a(41.46±1.5)a一步法(n=121)(15.2±3.6)b0.0±0.0b0.0±0.0b两步法(n=104)(62.5±1.0)c(48.6±8.4)c(10.3±2.5)c三步法(n=117)(71.4±1.2)d(50.3±14.6)c(12.7±2.2)c线性法(n=72)(83.6±6.1)e(72.4±3.9)e(21.5±3.7)e

注：不同字母表示组之间有显著性差异，P<0.05。

Note: Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

3 讨论

本研究首先对微流体线性法去除时间进行了优化，实验结果表明，随着去除时间的增加，细胞体积的改变量越小，说明细胞所受的渗透损伤越小，这是因为随着去除时间的延长，胞外缓冲液浓度(蔗糖浓度)的变化梯度减小，缩小了胞内外渗透压差，从而减小了细胞膨胀所带来的渗透损伤[17]。但采用10 min方案去除冷冻保护剂时，反而会对细胞造成更大的损伤，处理后卵母细胞的存活率、卵裂率及囊胚率分别仅为79.5%、54.4%、18.4%。究其原因，是10 min去除使得微通道内解冻液流量过小，流体雷诺数变小，层流边界层变厚，溶液黏性力变大，有可能造成流体流动形态的改变[18]，从而使高浓度解冻液在细胞腔内聚集，导致细胞在高浓度溶液中暴露时间过长。另外，去除时间过长，冷冻保护剂的洗脱效率下降，细胞在高浓度保护剂中暴露的时间太长，保护剂对细胞的毒性损伤作用抵消了细胞体积变化小带来的优势，反而不利于细胞的低温保存[17]。

采用不同方式去除胞内保护剂时，一步法的效果最差，细胞的最大渗透膨胀体积超过了其临界体积[19-20]，从而造成细胞膜结构和细胞骨架系统的损伤，处理后细胞的存活率、卵裂率、囊胚率分别为15.2%、0、0。采用两步法和三步法去除时，细胞体积的膨胀要明显减小一步法，说明分步法显著减小了细胞的渗透损伤[10,21]。Wang等比较了四步法添加、一步法和两步法去除对牛MII期卵母细胞发育潜能的影响[22]，结果表明两步法去除后细胞的卵裂率(62.6%)与一步法(60.4%)无显著性差异，但囊胚率(11.1%)要显著高于一步法(9.5%)。但分步去除冷冻保护剂时，细胞暴露在1 mol.L-1蔗糖溶液中，细胞的体积会出现先膨胀后收缩的现象，其原因可能是Me2SO分子快速流出细胞，使胞外溶液的浓度高于胞内，细胞开始逐渐脱水，与此同时，胞外的Me2SO分子与蔗糖分子相结合，抑制了水流入细胞。线性法去除对细胞的渗透损伤最小，处理后细胞的存活率、卵裂率、囊胚率都显著高于一步法和分步法，这一结果与Song等采用微流体装置加载并去除肝细胞低温保护剂的方法[23]类似，处理后肝细胞的存活率比一步法高25%，比两步法高10%。

4 结论

1)在37℃条件下，对于微流控线性法不同去除时间(6、8、10 min)，卵母细胞的体积都呈现先增大后减小的变化趋势，其中8 min为实验中的最优去除方案。该方案下细胞的存活率和卵裂率分别为88.7%、72.5%，均显著高于6 min(72.9%、64.6%)和10 min(79.5%、54.4%)(P<0.05)，但囊胚率为21.5%，略高于6 min(20.2%)和10 min(18.4%)，三者之间无显著性差异(P>0.05)。

2)线性法去除冷冻保护剂，卵母细胞的体积变化曲线比较平缓，其最大归一化渗透膨胀体积为1.12±0.07，明显小于一步法(1.92±0.04)和分步法(1.33±0.05)。用线性法处理，卵母细胞存活率、卵裂率及囊胚率分别达到了83.6%、72.4%、21.5%，均显著高于一步法和分步法(P<0.05)，说明微流控线性法去除保护剂对细胞的渗透损伤最小，用于卵母细胞冷冻保护剂的去除是有效的。

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Experimental Study of Linear Removing Cryoprotective Agents from MII Porcine Oocytes with Microfluidics Device

Zhou Xinli1*Yang Yun1Dai Jianjun2Zhang Defu2Shao Wenqi1Yi Xingyue1Tao Leren1

1(InstituteofBiothermalTechnology,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)2(AnimalandVeterinaryResearchInstitute,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201106,China)

Cryoprotective agents (CPAs) must be removed from cryopreserved oocytes before used in clinic. Step-wise methods usually lead to the cell loss due to complicated operating steps, and may cause fatal osmotic injury to oocytes during CPAs removal process. In order to minimize the osmotic injury to oocytes, a microfluidic device for unloading CPAs from oocytes was designed and fabricated in this study. CPAs were linear unloaded from MII porcine oocytes with microfluidic device under different durations (6 min, 8 min and 10 min), the cell volume changes and the effects on the survival and developmental rate of oocytes were investigated, and then compared with that obtained by the conventional step-wise methods. Results showed that 8 min duration was optimal for linear unloading CPAs with microfluidic device. The linear method remarkably reduced the osmotic injury to oocytes during the removal of CPAs. The highest normalized swelling volume of oocyte only reached 1.12±0.07. The survival, cleavage and blastocyst rate of oocytes were 83.6%, 72.4% and 21.5%，respectively, which were significantly higher than those of one-step method and step-wise methods (P<0.05). In conclusion, linear unloading CPAs with the microfluidic method can significantly alleviate the osmotic damage to oocytes, which may provide a new path for oocyte cryopreservation.

microfluidics; mixing; oocyte; CPA; osmotic injury

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 04.008

2016-09-20， 录用日期:2017-04-07

国家自然科学基金(51376132)

R318

A

0258-8021(2017) 04-0442-07

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: zjulily@163.com