碳纳米管对树突状细胞成熟和T细胞分化作用研究

代亚丽 聂 欣 刘 健 孟 洁 许海燕

(中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100005)

碳纳米管对树突状细胞成熟和T细胞分化作用研究

代亚丽 聂 欣 刘 健#孟 洁#*许海燕#*

(中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100005)

Th分化在免疫应答过程中起着关键性的作用，主要由树突状细胞来调控。碳纳米管是由碳元素组成的空心管状纳米材料，可作为抗原载体。碳纳米管对树突状细胞和Th分化的影响是决定其免疫响应的关键因素。分析氧化多壁碳纳米管(CNT)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)功能的影响，以及对过敏抗原多肽OVA323-339的 Th1和Th2免疫反应的影响。实验结果显示，BMDCs大量吞噬CNT，但对其细胞表面活化标志分子CD86、MHCII以及细胞因子TNF-α表达没有明显变化。CNT/抗原复合物可促进BMDCs表面MHCII的表达和CD8+T细胞增殖，增殖细胞的比例由28.7%分别增加到40.6%、41.3%和29.6%。Th2型细胞因子IL-4、IL-13和IL-10的表达和CD4+T的增殖受到抑制，增殖细胞的比例由54.4%减少到38.9%、46.6%和39.8%。研究结果提示，CNT不影响DCs的成熟和活化，但CNT可以影响过敏抗原的Th分化平衡，可抑制Th2型细胞因子的表达，促进Th1型免疫响应。

树突状细胞；碳纳米管；Th分化；抗炎细胞因子；过敏抗原

引言

碳纳米管具有典型的纳米结构和高比表面积，可以与生物大分子结合，易透过细胞膜被多种细胞摄取，可以作为生物分子的高效载体[1-5]。有研究将碳纳米管与手足口病多肽抗原结合，发现与传统的铝佐剂相比，碳纳米管引起了更强的特异性抗体产生[6]，可显著地促进半抗原特异性抗体产生[7]。此外，有研究称多壁碳纳米管可加重小鼠的过敏性呼吸道炎症反应[8-9]。

Th分化在免疫应答过程中起着关键性的作用，其中Th1分化促进CD8效应细胞的细胞毒及吞噬功能，Th2分化促进B细胞产生抗体[10-11]。Th2分化在过敏反应过程中发挥着关键作用， Th2型细胞因子(特别是IL-4和IL-13)可激活Th2型免疫反应[12-13]。OVA323-339多肽是卵清蛋白(ovalbumin，OVA)的过敏抗原表位，主要与MHCII分子结合，引起过敏反应[14]。碳纳米管是否促进过敏抗原的免疫效应，是值得关注的问题。本研究制备了水分散性的氧化多壁碳纳米管，通过透射电镜、特异性抗体、ELISA试剂盒等，检测了碳纳米管及其负载OVA323-339抗原后对小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞和淋巴细胞活化情况的影响，分析氧化多壁碳纳米管对过敏抗原免疫反应的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂与材料

健康雌性C57BL/6小鼠购自维通利华动物技术有限公司，重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)购自PEPROTECH公司，卵清蛋白抗原多肽OVA323-339购自南京金斯瑞生物科技有限公司，CpG寡聚核苷酸(ODN 1826)购自InvivoGen公司，抗小鼠CD11c、MHC II、CD86、CD4和CD8以及小鼠IL-4、IL-10、IL-13和TNF-α ELISA试剂盒购自eBioscience公司，原始多壁碳纳米管(50 μm)购自中科院成都有机化学有限公司。

1.2 碳纳米管的氧化处理

多壁碳纳米管的氧化过程参考文献[15]的方法，将原始多壁碳纳米管加入到混合浓酸中(浓硝酸∶浓硫酸=1∶3)，超声探头处理后纯水洗涤至中性并干燥，得到氧化碳纳米管(oxidized carbon nanotubes，CNT)。将CNT灭菌处理后，在超声探头辅助下分散到培养基中，离心收集上清，得到CNT培养基溶液。

1.3 体外诱导、培养小鼠骨髓来源树突状细胞

将4周龄C57BL/6小鼠断颈处死，浸入75% 酒精30 s后，在超净台中分离小鼠的股骨和胫骨。剪断两端骨帽后用RPMI 1640培养基冲洗骨髓腔，经洗涤、红细胞裂解后，将含GM-CSF的完全培养基(10 ng/mL GM-CSF、10% FBS)加入到骨髓细胞中。隔天半量换液至第6 d，细胞表面可观察到明显的刺突形成，收集悬浮细胞，得到小鼠骨髓细胞来源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)[16]。将CD11c抗体加入到细胞悬液中，4℃孵育1 h后流式细胞仪(Accuri C6，BD)检测。将10 μL细胞悬液滴于载玻片上，自然晾干后用瑞士-吉姆萨溶液染色，中性树脂封片后油镜(Olympus IX53)观察细胞形态。

1.4 CNT对BMDCs活性的影响

将不同浓度的CNT(0.01、0.03和0.1 mg/mL)加入到BMDCs中，37℃、5% CO2培养24 h后收集细胞，将CD11c抗体加入到细胞中。利用流式细胞仪分析CNT对BMDCs活性的影响。在流式散点图中，活细胞具有较大的前向光(FSC)和侧向光(SSC)。通过圈门选出较大FSC和CD11c+细胞在所有细胞中的比例，可分析不同浓度CNT对BMDCs活性的影响。

1.5 BMDCs对CNT的摄取

将CNT(0.03 mg/mL)加入到BMDCs中，37℃、5% CO2孵育24 h后，收集细胞团。经戊二醛固定、洗涤、锇酸固定、乙醇脱水和树脂包埋后，将CNT处理的BMDCs细胞制备成超薄切片后，利用透射电镜(TEM, JEM-1400-plus)观察BMDCs对CNT的摄取情况。

1.6 CNT对BMDCs成熟和活化的影响

CNT/CpG混合物的制备：将CNT与CpG充分混合(0.03 mg/mL CNT:1 μM CpG)，室温放置30 min后，得到均匀稳定的混合液。将不同浓度的CNT溶液(0.01、0.03和0.1 mg/mL)、CpG(1 μM)和CNT/CpG混合液(CpG终浓度为1 μM)加入到BMDCs中，培养箱中培养 24 h后，分别收集上清和细胞。利用ELISA试剂盒检测上清中TNF-α的表达；利用流式细胞仪，分析BMDCs活化标志分子CD86和MHCII的表达。

1.7 CNT对BMDCs抗原提呈的影响

将OVA323-339(O-3)抗原加入到不同浓度的CNT溶液中，室温条件下充分混合后放置30 min，得到O-3/CNT抗原复合物。将3种不同CNT浓度的复合物加入到BMDCs中，其中CNT的浓度分别为0.01、0.03和0.1 mg/mL，O-3的终浓度为10 μg/mL，37℃孵育48 h。将MHCI、MHCII抗体加入到复合物处理的BMDCs中，分析CNT对抗原提呈的影响。

1.8 混合淋巴细胞反应

图1 BMDCs的体外诱导、培养和碳纳米管对细胞活性的影响。(a)小鼠骨髓细胞诱导培养6 d后，细胞表面高表达CD11c，细胞表面可见大量刺状突起，从左到右依次为空白细胞散点图、CD11c标记后散点图、BMDCs的CD11c表达柱状图以及透射电镜观察到的BMDCs的形态图，内插图为瑞士-吉姆萨染色的染色图；(b)不同浓度CNT对BMDCs活性的影响，从左到右依次为对照、0.01、0.03和0.1 mg/mL处理的BMDCs的活细胞比例Fig.1 The induction and cultivation of BMDCs in vitro and the effects of CNT on BMDCs viability. (a) Bone marrow cells were induced to dendritic cells with spikes on the surface of cells and high CD11c expression; The plot of BMDCs cell, CD11c labeled BMDC plot and histogram, and cell morphology observed by TEM were showed from the left to the right. (b) The effect of CNT on BMDCs viability; the viable BMDCs cell ratio treated without CNT, 0.01, 0.03 and 0.1 mg/mL CNT were shown from the left to the right

将六周龄雌性C57BL/6小鼠断颈处死后，浸泡到75%酒精中30 s。在超净工作台中解剖取出小鼠脾脏，研磨过筛得到脾细胞悬液。将细胞悬液缓慢地加入到淋巴细胞分离液上层，400 g室温离心30 min。轻轻取出中间淋巴细胞层到离心管中，加入PBS清洗2遍后计数。将CSFE加入到淋巴细胞中(终浓度为1 μM)，37℃孵育20 min后离心洗涤，得到CSFE标记淋巴细胞。

将标记后的淋巴细胞加入到不同浓度O-3/CNT复合物处理的BMDCs中，淋巴细胞和BMDCs的比例为10∶1。培养5 d后收集上清和细胞，利用ELISA试剂盒检测上清中IL-4、IL-13和IL-10的量；利用CD4和CD8抗体标记T淋巴细胞，检测两群细胞的增殖情况。

1.9 统计学分析

每个实验设3个重复样，数据表示为平均值±标准差。显著性差异利用SPSS软件单因素方差分析(ANOVA)进行分析，流式数据用CFlowTM软件(Accuri Cytometers)和FlowJo软件(Treestar，美国)进行分析。

2 结果

2.1 碳纳米管对BMDCs活性的影响

小鼠骨髓细胞经GM-CSF体外诱导培养6 d后，细胞表面出现典型的刺突结构，高表达DCs特异性标志物CD11c。瑞士-吉姆萨染色显示，细胞表面有大量褶皱和不规则突起，具有典型的DCs形态。在透射电镜下观察到细胞表面有较多的突起，细胞核偏于一侧(见图1(a))。这些结果确定得到的细胞为树突状细胞(BMDCs)。

根据CD11c的表达和前向光(FL1-A/FSC)的大小，可在流式散点图上圈出BMDCs，分析CNT对BMDCs细胞活性的影响。将不同浓度的CNT与BMDCs孵育24 h后，3种浓度的碳纳米管都降低了BMDCs的活性，由对照组的89.8%降低到86.9%、87.5%和84.1%，提示CNT对BMDCs活性无明显影响(见图1(b))。

2.2 BMDCs对碳纳米管的摄取

将CNT与BMDCs孵育24 h后，在透射电镜下可观察到CNT被大量吞噬到细胞内，细胞核内未见(见图2)。被BMDCs吞噬的碳纳米管聚集成团，有少量碳纳米管单根存在。

图2 利用透射电镜观察BMDCs摄取碳纳米管情况。(a)CNT被BMDCs摄取；(b)为(a)的局部放大Fig.2 CNT uptake of BMDCs observed by TEM. (a) CNT was engulfed by BMDCs. (b) The partial magnification of (a)

2.3 碳纳米管对BMDCs成熟和抗原提呈的影响

树突状细胞摄取抗原或被某些刺激因素处理后逐渐成熟，细胞表面高表达CD86和MHCII分子，同时释放细胞因子(如TNF-α、IL-12等)。CpG可直接激活树突状细胞，上调共刺激分子的表达，加强免疫反应。实验结果表明，3个浓度的CNT(0.01、0.03、0.1 mg/mL)都不影响BMDCs表面CD86和MHCII的表达，CpG可显著提高BMDCs表面MHCII的表达，使CD86的表达略有增加，但与对照组相比没有显著性差异。CNT/CpG复合物可以进一步促进BMDCs表面CD86和MHCII的表达，但与单独CpG相比没有显著性差异(见图3(a)、(b))。

进一步对碳纳米管影响BMDCs释放TNF-α的情况进行了分析。实验结果发现，CNT(0.03 mg/mL)可略降低TNF-α的表达，但没有显著性差异；CpG刺激可显著促进TNF-α的表达，CNT/CpG复合物可稍抑制TNF-α的表达，但不具有显著性差异(见图3(c))。这些结果提示，CNT不影响BMDCs的成熟和活化，也不干扰CpG引起的BMDCs的成熟和活化。

图3 CNT对BMDCs成熟的影响。(a)不同处理因素对BMDCs表面CDMHCII平均荧光强度的影响;(b)不同处理因素对BMDCs表面CD86平均荧光强度的影响；(c)不同处理因素对BMDCs表达TNFα的影响(*P<0.05,**P<0.01 vs Con)Fig.3 The effect of CNT to BMDCs maturation. (a) Mean fluorescence intensity of MHCII； (b) Mean fluorescence intensity of MHCII expression on the surface of BMDCs after different treatment； (c) TNFα expression with different treatment (*P<0.05,**P<0.01 vs Con)

树突状细胞摄取抗原后，经过胞内途径与MHCI或MHCII类分子结合，形成MHC-抗原复合物被转运到细胞膜上，提呈给CD8+或CD4+T细胞。膜表面MHCI和II分子的表达是决定树突状细胞抗原提呈的关键分子。实验结果显示，低浓度的O-3/CNT抗原复合物(0.01 mg/mL)可促进MHCI类分子的表达；高浓度的CNT/抗原复合物处理后，BMDCs表达MHCI分子的水平降低。3个浓度的CNT/抗原复合物都提高BMDCs细胞表面MHCII类分子的表达，且具有CNT浓度依赖性，CNT浓度越高，复合物对MHCII表达的促进作用越明显(见图4)。

图5 O-3/CNT复合物处理BMDCs对淋巴细胞功能的影响。(a)3个CNT浓度的O-3/CNT复合物处理的BMDCs对淋巴细胞IL-4、IL-13和IL-10表达的影响(*P<0.05，**P<0.01 vs O-3 without CNT);(b)3个CNT浓度的O-3/CNT复合物处理的BMDCs对CD4+T和CD8+T细胞增殖的影响Fig.5 Mix lymphocytes reaction induced by the mixture of O-3/CNT treated BMDCs.(a)IL-4, IL-13 and IL-10 expression of lymphocyte measured by ELISA kit (*P<0.05,**P<0.01 vs O-3 without CNT);(b)CD4+T and CD8+T cell proliferation.

图4 O-3/CNT复合物对BMDCs细胞表面MHCI(a)和MHCII类分子(b)表达的影响Fig.4 The mixture of O-3/CNT antigen influences on the MHCI (a) and MHCII (b) expression of BMDCs

2.4 混合淋巴细胞反应

将O-3/CNT抗原复合物处理的BMDCs与同种小鼠脾淋巴细胞混合培养，分析淋巴细胞的细胞因子表达和增殖情况。实验结果显示，O-3/CNT复合物处理的BMDCs细胞可显著降低Th2型细胞因子IL-4和IL-13的表达，对IL-10的表达略有影响(见图5(a))。淋巴细胞增殖实验结果显示3个CNT浓度的抗原复合物处理的DCs降低了CD4+T淋巴细胞增殖，低CSFE表达的CD4+T的比例从对照组的54.4%降低到38.9%、46.6%和39.8%。与CD4+T细胞反应不同，O-3/CNT复合物处理DCs可以显著促进CD8+T淋巴细胞增殖。特别是0.01和0.03 mg/mL的CNT，分别将低CSFE表达的CD8+T细胞比例从对照组的28.7%提高到40.6%和41.3%。但是，高浓度(0.1 mg/mL)O-3/CNT复合物处理的DCs对CD8+T细胞增殖的促进作用较弱(见5(b))。

3 讨论

有研究表明，树突状细胞通过调节抗原与MHC类分子结合和释放细胞因子，调控Th分化[17]。本研究发现，BMDCs可以大量吞噬碳纳米管，其表面活化分子MHCII、CD86和TNF-α表达没有明显变化。有研究发现，功能化多壁碳纳米管对骨髓来源的树突细胞细胞表面活化标志物表达没有影响，碳纳米管对树突状细胞抗原递呈作用的促进来源于其促进抗原的摄取[18]。通常OVA323-339抗原多肽被DCs摄取后，与MHCII分子结合，激活CD4细胞，抑制CD8细胞增殖，促进Th2分化。少量抗原-MHCII复合物可以通过“交叉呈递”的方式，进入MHCI类抗原呈递途径，促进CD8+T增殖和Th1分化。碳纳米管运载抗原在树突状细胞内的转运过程与单独抗原分子可能不同。碳纳米管负载OVA323-339后，促进BMDCs表面MHCII分子的表达，抑制Th2型细胞因子的表达，促进CD8+T细胞的增殖。这提示碳纳米管有可能促进OVA323-339抗原通过MHCII类分子途径递呈给CD8+T细胞，同时抑制Th2型细胞因子的表达。有研究发现，结核菌素-单壁碳纳米管复合物可以促进免疫反应由Th2型向Th1型转变，促进IFN-γ的表达[19]。氧化多壁碳纳米管可以促进多肽特异性的CD8+T细胞的增殖，促进抗肿瘤免疫治疗效果[20]。多壁碳纳米管如何调控Th分化和抗原交叉递呈的相关机制尚需进一步深入研究。

4 结论

BMDCs可以大量吞噬CNT，增加MHCII的表达，促进OVA323-339多肽抗原的呈递和CD8+T淋巴细胞的增殖，抑制Th2型细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的表达，使免疫反应由Th2向Th1型转变。CNT可以通过增加抗原的摄取和交叉提呈，促进细胞免疫响应，有望成为一种新型抗原载体。

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Carbon Nanotubes Influence Dendritic Cells Maturation and T Cell Polarization

Dai Yali Nie Xin Liu Jian#Meng Jie#*Xu Haiyan#*

(InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences&SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)

Th differentiation play a key role in modulating immune response, which is mainly controlled by dendritic cells (DCs). Carbon nanotubes are unique nanomaterials composed of carbon element with hollow tube structures, which could be used as antigen carrier. The interaction of carbon nanotubes with DCs is key factor modulating following immune responses. This work studied the interaction between oxidized multiwalled carbon nanotubes (CNT) and DCs, and the mixture of CNT and allergic antigen peptide OVA323-339(O-3) on DCs and DCs-mediated Th1/Th2 responses. Our results showed that CNT was engulfed by DCs, and the expression of MHCII, CD86 and TNF-α of DCs was unchanged by CNT. The mixture of CNT/O-3 treated DCs induced increased CD8+T cell proliferation. The proliferation ratio of CD8+T cells increased from 28.7% of control to 40.6%, 41.3% and 29.6%. Th2 cytokines expression of IL-4, IL-10 and IL-13 was significantly inhibited. The proliferation ratio of CD4+T cells were decreased from 54.5% of control to 38.9%, 46.6%, and 39.8%. All the results indicated that CNT did not influence the maturation of DCs but promote Th1 polarization of T cells by inhibiting the Th2 cytokines expression of allergic peptide antigen.

dendritic cells; carbon nanotubes; Th polarization; anti-inflammatory cytokines; allergic antigen

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 04.011

2017-03-15， 录用日期:2017-04-30

北京市自然基金(7162128)；协和青年基金(3332016136)

R318

A

0258-8021(2017) 04-0464-06

# 中国生物医学工程学会会员(Member, Chinese Society of Biomedicial Engineering)

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: mengjie@ibms.pumc.edu.cn； xuhy@pumc.edu.cn