腹壁撤退反射实验测量方法概述

陈 颖，赵 妍，罗丹妮，黄 辰，周思远

研究进展

腹壁撤退反射实验测量方法概述

陈 颖，赵 妍，罗丹妮，黄 辰，周思远*

内脏高敏感是功能性消化不良、肠易激综合征、功能性腹痛等功能性胃肠病的重要发病原因之一，在上述疾病动物模型的评价中，是否存在内脏高敏感，是判断模型成功的关键。目前应用最广的评价动物内脏敏感性的方法为腹壁撤退反射实验[1]，该方法通过扩张肠道，观察动物的行为学反应来进行评价，操作简单易行，对模型动物伤害较小，不易对后继的研究造成影响[2]。然而，在目前AWR实验的实际操作中，测量方法存在标准不统一，操作过程中的多种因素均可影响到实验结果，可能导致对实验动物内脏敏感性的评价有误，从而影响以内脏高敏感为特点的动物疾病模型评估。因此本文对AWR的测量方法进行整理与分析，现综述如下：

1 AWR操作的基本步骤

现有文献中，AWR实验的操作步骤大致如下：大鼠实验前12 h[2-4]或18 h[6,7]或24 h[8,9]内禁食不禁水，实验前用少量乙醚麻醉大鼠，把固定在导管一端的气囊经石蜡油润滑后，经大鼠肛门插入一定深度，用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起，以固定气囊。将大鼠放在不能转身的透明塑料笼内，待其适应至完全平静后，缓慢向气囊内注水或注气以扩张肠道，分别观察不同压力值下腹部回缩反射，每次扩张持续一定时间，对每一压力值进行重复测量，同时给予评分，以得分高低判断内脏敏感性程度。

2 不同测量方法之间的差异

2.1 扩张方式

实验中常用的直肠扩张方式包括血压计注气、注射器注气、注射器注水三种，以血压计注气最为常见。血压计注气的方式是按血压计每10 mmHg[22,27]或5 mmHg[12,30,32]上升的速度注入空气，这常在20,40,60,80 mmHg四个等级强度[7,10,11,13,14,16,18-20,28]的压力下分别观察动物的行为学反应。注射器注气可以将压力表、注射器和导管分别经三通管连接，由注射器注入空气，多在20,40,60,80 mmHg[15,17,22,34]的压力下展开观察。另一种方法则采用注射器直接注入空气，并在各体积下分别观察动物的行为学反应。注射器注水的方式多按0.2,0.4,0.6,0.8,1.2 mL[23,29]的规格依次缓慢注入生理盐水[4,23]或26℃～28℃[4]温水。

2.2 气囊种类与制作方法

目前AWR实验中使用的气囊包括三类：橡胶指套、气球和球囊。橡胶指套使用率最高，多采用外科医用手套中号，选用中指段[1,3,13,14,28,30,33]。气球多选用橡胶气球[11-13,32]和硅油气球[8]。以上两种方法制作时用直尺在4.5 cm及6 cm处划线标记，从6 cm处剪断，用4号手术丝线在4.5 cm标记处与导管扎紧[2,3]，并用胶布加固，然后经注气检测，扎口处无漏气即可。球囊则多使用血管扩张球囊。

2.3 各实验结果出现明显差异时，所对应的压力值

通过对各实验模型组与正常组的评价结果进行整理，我们发现：不同的实验在同一扩张方式下，内脏敏感性出现明显差异时，所对应的压力值并不是相同的。如：经血压计注入空气时，大部分实验在40、60 mmHg[11,13,33]或20、40、60、80 mmHg[16,19,30]的压力下，实验结果出现明显差异；若注射器、血压计通过三通管连接，差异明显的实验结果所对应的压力值多为20、40、60、80 mmHg[18]。经注射器直接注入空气的方式，其评价结果在0.4 mL的压力下表现出明显差异[8]；而经注射器注水的实验，其结果多在0.8、1.2 mL[23]或0.2～1.0 mL[31]压力下表现出明显差异。

2.4 判断标准

目前，常用的判断标准包括：腹部收缩[12,13,22,28,32]、AWR等级评分[1,5,7,10,11,14,18,21,31,33-36]和AWR 3分阈值[2,3,9,24-27,37-39]。腹部收缩是以大鼠腹部出现收缩时，所对应的压力或容量值为评价结果。AWR等级评分的评分标准为：0分，给予结直肠扩张刺激时大鼠无行为学反应；1分，给予刺激时变得不稳定，偶尔扭动头部；2分，腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面；3分，腹背部肌肉较强烈收缩并把腹部抬离地面；4分，腹部肌肉强烈收缩，腹部呈弓形并把腹部、会阴部抬离地面。为减少误差，取相同压力下重复评分的平均值作为该压力下的评分值。另外，AWR 3分阈值是以大鼠腹部抬起和背部拱起为评价标准，用以评估大鼠内脏敏感性的压力或容量阈值。实验中为减少误差，不管采用何种测量方法，都多取重复测量的平均值作为最终判断标准。

2.5 其他因素

该实验使用导管以导尿管[1-5,8,9,25-27]为主，其余常用聚乙烯管[6,13-15,28,30,33]。导管直径多数为2.7 mm[5,38]，或直接使用8F导尿管[2-4,9,26,27]。气囊插入大鼠肛门的深度以6～8 cm[2,13,28,29,33,34]]居多，2 cm[18,31]次之。在每个相同压力值下进行扩张的持续时间，绝大多数实验为20 s[10,11,13,14,16-20]，其次为30 s[7,8,26,30-32]。每个相同压力值的重复次数在绝大多数AWR实验中，均为3次[2-6,9,10,34-38]。每次扩张的间隔时间，大部分实验为4 min[19,22,30-33]，其次为5 min[2,3,12,16,20]。而气囊插入大鼠肛门后，大鼠在容器里适应至完全平静的时间，在绝大多数实验中为30 min[1,5,30-33,37]。此外，对盲观察者的设置有具体说明的文献和对其未提及的文献数目相当。其中盲观察者人数设置少的为2人[2,6,19,32]，最多达3人[16]，其余文献对具体数目均未作说明[3,8,12-15,33]。

3 讨论

是否存在内脏高敏感，是判断功能性消化不良、肠易激综合征、功能性腹痛等功能性胃肠病动物模型成功的关键。腹壁撤退反射评价，是目前应用最广的评价动物内脏敏感性的方法，是一种包括多因素在内的综合操作方法，但目前鲜有较为公认的测量细节，缺少统一的测量标准，导致AWR实验操作不规范，进而影响内脏敏感性评价结果的准确性。

从文献回顾的情况看，目前常用的扩张方法有以下三种：血压计注气、注射器注水、注射器注气。其中使用最多的是用血压计注入空气，该方法的优点体现在：1.操作简便易行，方便实验者更直观地观察压力值，当操作过程中发生漏气时能迅速被观察者察觉；2.气囊内压力易排尽，避免了气囊内气体对下一次测量的干扰。该方法的缺点在于压力的变化受气囊材质和形状的影响较大。经注射器注水和经注射器注入空气的扩张方式，两者的优点均在于可等体积注入压力。而注水法的缺点在于每次扩张结束时，气囊内的水无法排尽，可能引起对下一次测量结果的干扰。注气法的缺点是漏气后无法直观发现，不易察觉。

而在同一扩张方式下，实验结果出现明显差异时，不同实验者观察到的压力值并不相同。这种不同可能与AWR实验整个操作过程中涉及到的多个因素密切相关。结合文献与既往实验研究，推测有以下几个主要因素对不同实验结果产生了干扰。

第一：气囊的材质和形状。使用球囊时，实验结果多在20、40、60、80 mmHg时表现出明显差异[3,16,18]；使用橡胶气球、橡胶外科医用手套时，实验结果多在40、60 mmHg时表现出明显差异[11,13,19,33]；而使用硅油气球时，该值为0.4 mL[8]。在以上四种气囊中，球囊是聚乙烯材质，而橡胶气球、橡胶外科医用手套、硅油气球均为橡胶材质，但三者的形状与厚度均有差异。橡胶材料力学性质复杂，胡斌等[40]发现在线性应变阶段，气球内部的压强会随着气球体积的增大而上升，但当压强达到其峰值后，气球内部的压强反而会随着气球体积的增大而减小。因此不同材质气球的压强，并不都是随着注入气体的增多而相应增大。不同材质的气球之间，随注入的气体量而产生的压强变化存在着较大差异，故对AWR实验结果造成的影响也不同。在直结肠扩张中，气囊可能作为主要工具，对整个实验的结果造成主要的影响，基于此，本团队将在后续的研究中对不同材质和形状的气囊进行实验对比验证，从中筛选出最适合作为气囊的原料。

第二：插入的深度。气囊插入肛门的深度不同，所刺激的肠道部位也不同。当插入2 cm深时，刺激部位为直肠；插入6～8 cm时，刺激的是降结肠和直肠。大多数实验选择的深度为6～8 cm，即刺激结直肠部位。有研究表明，功能性胃肠病患者的肠腔内环境，如碳水化合物吸收障碍导致的腔内高渗和高酸，可能改变结直肠传入神经的兴奋性和相对比例，从而诱发结直肠对扩张的高敏感[41]。故在AWR实验中，刺激结直肠部位比刺激直肠部位对扩张更敏感，故选取6～8 cm更具科学性和可操作性。

第三：判断标准。以腹部收缩为标准的评价方式，简单直观，但易受大鼠呼吸及排泄等生理反应的影响，产生的结果存在主观偏倚。采用AWR等级评分作为判断标准，要求实验者熟练掌握并能准确辨别出0～4分所对应的行为学反应，操作过程不但耗时，且反复测量易对大鼠结直肠造成伤害。AWR 3分阈值，是近年来很多学者为了避免主观误差，在传统的AWR评价方法上进行的改良：仅以直肠扩张时大鼠腹部抬高和背部拱起这两种比较明显的行为特征为标准，评估大鼠的容量阈值[1,39]，该标准操作步骤简洁，标准单一。

此外，每次扩张的持续时间、重复次数、每次扩张之间的间隔时间以及气囊插入肛门后，大鼠在容器内适应至完全平静的时间，是决定大鼠进行每次扩张时，是否处于完全平静状态的关键。若扩张时间过长，重复次数过多，间隔时间过短，则会造成大鼠恢复至平静的时间越长，同时对大鼠造成不同程度的损伤；若扩张时间过短，重复次数过少，则不能全面准确地观察大鼠的实际反应状态，以上情况均会导致实验结果不准确。故找到以上因素起作用的最小临界点，既可以避免由于大鼠状态未归于平静的干扰，又可以节约实验的操作时间，提高实验效率。在实验过程中若设置有盲观察者，可减少主观偏倚，使实验结果更为客观真实有说服力，增加了实验设计的科学性与严谨性。

4 小结

综上所述，建议对AWR实验的操作方法为：大鼠实验前12～24 h内禁食不禁水，开始操作前用少量乙醚麻醉大鼠，将固定在8F导尿管一端的圆形橡胶气球经石蜡油润滑后，经大鼠肛门插入4.5 cm深，用胶布把导管和大鼠尾巴根部缠在一起，以固定气囊。将大鼠放在不能转身的透明塑料笼内，待其适应至平静后，经血压计按10 mmHg的速度匀速加压观察3分阈值时对应的压力值。重复扩张3次，每次扩张持续20 s，取平均值作为评分值。此外，在实验过程中操作者与评价者应互相隔离，互不干扰，以减少主观偏倚。对该方法的验证将在今后的实验中进一步深入阐释，以期推动AWR实验的标准化研究，形成规范的统一标准。

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(成都中医药大学针灸推拿学院，成都 610075)

腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)实验，通过扩张肠道来评价动物的行为学反应，是目前应用最广的评价动物内脏敏感性的方法。然而，AWR实验操作涉及因素多，目前鲜有较为公认的操作规程。本文通过对涉及AWR实验测量方法的文献进行梳理，归纳出AWR操作的基本步骤，总结不同测量方法在扩张方式、气囊种类等相关因素方面的差异，并对相关因素的具体操作提出建议，以期为后续使用该方法评价动物内脏敏感性的研究者提供选择方法，为实验操作的标准化方案制定奠定必要基础。

腹壁撤退反射实验；测量方法；标准化

A summary of measurement methods for abdominal withdrawal reflex test

CHEN Ying， ZHAO Yan， LUO Dan-ni， HUANG Chen， ZHOU Si-yuan*
(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China)

Abdominal withdrawal reflex (AWR) test, which evaluates the behavioral response of animals through expanding the intestinal tract, is the most widely used method to assess animal’s visceral sensitivity in recent years. However, as AWR experimental operation involves many factors, it’s hard to find a commonly recognized operating procedure. Through review of literature of AWR experimental measuring methods, this article summarizes the basic steps of AWR operation. Meanwhile, it scrutinizes the differences of various measuring methods in relevant factors, including expansion method and airbag method, with special operating suggestions to them. Hopefully, this article will provide an option to future researchers who will use this method to evaluate animal’s visceral sensitivity, and provide a necessary foundation for the standardization of the experimental operation.

Abdominal withdrawal reflex test; Measurement methods; Standardization

国家自然科学基金(81503665)。

陈颖(1991-)，女，硕士生。研究方向：循证医学与针灸临床疗效与评价。E-mail: 343047239@qq.com

周思远(1984-)，女，讲师，博士生。研究方向：针灸治疗消化系统疾病的效应与机制研究。E-mail: zzsy6688@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0089-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.018

2016-11-24