胆道闭锁患儿血清血红素氧化酶-1水平的检测及其临床意义

曹顺琪，郑虹，孙超（. 天津医科大学一中心临床学院，天津市器官移植重点实验室，天津 3009； .天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 3009）

血红素氧化酶1（hemeoxygenase-1，HO-1）是血红素代谢途径中的限速酶，其本质为热休克蛋白，目前发现3种类型的HO，即HO-1、HO-2和HO-3，应激时主要由HO-1发挥作用，可将血红素分解为铁离子、胆绿素与一氧化碳等产物，胆绿素随后转化为胆红素。HO-1具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、免疫调节和诱导自噬等功能［1］。近年来，研究发现HO-1的表达增加可以减轻肝脏缺血/再灌注损伤及移植后排斥反应［2-4］。胆道闭锁（biliary atresia， BA）是婴幼儿肝病肝移植的主要适应证［5-6］。因此，本研究选取原发病为BA的患儿作为研究对象，旨在探讨BA患儿血清HO-1表达水平及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取天津市第一中心医院2015年10月1日-2015年12月31日接受亲属活体供肝移植的BA患儿20例，其中男性8例，女性12例，中位年龄9个月（7.1～12.8个月），体重为（8.0±1.2）kg，肝移植术前儿童终末期肝病模型评分 （pediatric of end-stage liver disease， PELD）中位数为16分（8～17.8分），肝功能Child-Pugh B级患者14例，C级6例。所有受者均经剖腹探查或腹腔镜探查、胆道造影、葛西（Kasai）手术及病理检查明确诊断为BA。

1.2 研究分组：选取20例BA患儿作为实验组。对照组为5例在天津市妇女儿童保健中心接受体检的健康儿童，其中位年龄为10个月，平均体重（10.2±1.9） kg。

1.3 伦理学：本研究符合医学伦理学标准，患者临床资料完整，其法定监护人均签署知情同意书。

1.4 检测项目：分别于术前1周的清晨抽取受者外周静脉血2 ml，将受者外周血样本静置30分钟，离心后收集上清液，并按1次用量分装，于-80℃下冷冻保存、待测，避免反复冻融。同时记录检测患儿直接胆红素值。

1.5 HO-1的检测方法：应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清HO-1的表达水平。将试剂盒中样本稀释液与样本按3：1配比，吸取混合好稀释样本 50 μl外加缓冲液 50 μl共 100 μl依次加入酶标板孔中，预留孔加入标准品；将待测样本于25℃孵育2小时；反应后洗板4次，加入生物素抗体工作液（100 μl/孔），于25℃条件下孵育1小时；洗板4次，继续加入辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase， HRP）标记的链霉亲和素工作液（100 μl/孔），于25℃下孵育30分钟；洗板4次，每孔加入100 μl ELISA酶-底物显色工作液（TMB），避光孵育30分钟后显示明显的梯度蓝，每孔加入100 μl TMB终止液。10分钟内用酶标仪在450 nm处测定吸光度值（A值）。根据由标准品孔对应的A值和相应标准浓度绘出标准曲线，根据测得A值在标准曲线坐标得出相应的HO-1浓度。

1.6 统计学分析：应用SPSS 20.0统计软件进行统计处理，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。非正态分布的计量资料以中位数（四分位）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HO-1测定值对比结果（图1）：术前20例BA 患儿的 HO-1为 11 μg/L（9～ 16 μg/L），明显高于对照组健康儿童的3.7 μg/L （2.6～4.5 μg/L），两组差异有统计学意义（Z＝3.196，P＜0.05）。

图1 各组儿童HO-1测定值的比较

2.2 HO-1与直接胆红素的关系（图2）：20例BA患儿的HO-1测定值与术前直接胆红素水平呈正相关（相关系数R＝0.576，P＝0.008）。

图2 术前直接胆红素水平与HO-1测定值的相关性分析

3 讨 论

BA导致的终末期肝病是儿童原位肝移植最主要的适应证之一。虽然BA患儿可以接受葛西手术治疗，但存在诸多术后并发症［7］，最终仍需接受肝移植治疗。HO-1对肝功能起保护作用。

本研究表明，BA患儿血清HO-1表达水平高于同龄健康儿童，其原因可能是：① 既往研究中HO-1在生理状态下不表达或低表达，在缺血、缺氧、高温、内毒素血症、氧自由基增多、金属离子过度负荷等应激状态下，HO-1表达水平明显升高［8］，胆道梗阻患儿处于高胆红素血症、肝硬化的病理状态，因此HO-1代偿性升高；② 新生儿期肝胆疾病直接胆红素是具有特异性的敏感指标［9］，胆道梗阻状态下以直接胆红素升高为主。且本研究结果显示，直接胆红素与血清HO-1的表达水平呈正相关；③ 有研究结果显示，胆道梗阻状态下HO-1的表达量增加，且HO-1随梗阻时间延长而升高［10］。

我们同时对术前直接胆红素水平和HO-1测定值进行了相关性分析，结果显示BA患儿的HO-1测定值与术前直接胆红素水平呈正相关。HO-1是分解血红素最终至胆红素上游代谢的起始酶和限速酶，主要过程为HO-1将血红素分解为铁离子、胆绿素与一氧化碳等产物，胆绿素随后转化为胆红素。关键酶增多使下游底物增多。Kaplan等［11］研究认为，新生儿黄疸导致的高胆红素升高是由于HO-1基因多态性导致的。另外，本研究缺乏对移植术后HO-1表达水平的检测，在今后的研究中会予以补充。Geuken等［12］研究原位肝移植受者肝脏HO-1 mRNA发现，与供肝HO-1 mRNA初始表达量高者相比，供肝HO-1 mRNA初始表达量低的受者术后更能诱导HO-1的表达升高，对肝脏的保护作用强。Matsumi等［13］对29例活体供肝移植术后缺血/再灌注损伤的研究发现，HO-1参与移植物早期的功能恢复。

目前，对BA乃至儿童肝移植领域HO-1的研究尚不完善，诱导HO-1表达作为临床治疗方法的探索较难有进展，血清检测HO-1更是鲜有报道。BA患儿血清HO-1水平升高与胆道梗阻程度相关。希望这一结论能为BA患儿血清HO-1表达及其应用提供新线索。