应用骨髓间充质干细胞复合关节软骨脱细胞基质修复兔软骨缺损的实验研究

张志勇 于光屹 陶丹丹 王惠亭 方世宇

（大连大学附属新华医院骨科，辽宁 大连 116021）

应用骨髓间充质干细胞复合关节软骨脱细胞基质修复兔软骨缺损的实验研究

张志勇 于光屹 陶丹丹 王惠亭 方世宇

（大连大学附属新华医院骨科，辽宁 大连 116021）

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合关节软骨脱细胞基质修复兔关节软骨缺损的效果。方法选取36只3～4个月龄的健康新西兰兔，分离其骨髓间充质干细胞（BMSCs），并在体外进行培养扩增。将BMSCs与关节软骨脱细胞基质在体外培养瓶中进行复合培养约3 d。将实验对象随机分为3组，分别进行3种不同的处理，实验结果用关节软骨组织学评分标准进行评分。结果移植手术后12周，移植培养好的骨髓间充质干细胞和关节软骨脱细胞基质复合物的实验组修复组织和周围组织整合良好，且修复效果显著优于移植单独的关节软骨脱细胞基质组和空白对照组。结论应用骨髓间充质干细胞和关节软骨脱细胞基质的复合物能有效的修复兔关节软骨缺损。

骨髓间充质干细胞；关节软骨脱细胞基质；软骨缺损；组织工程学

关节软骨能通过缓解关节压力来维持关节的正常功能，在关节的活动中起着至关重要的作用[1]。软骨损伤是一种非常常见的骨科疾病，通常由创伤、肿瘤或感染等原因造成，是临床治疗中一个非常棘手的问题[2-5]。本研究用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，用关节软骨脱细胞基质作为支架材料，将二者形成的复合物移植到兔软骨缺损部位。

1 材料与方法

1.1 实验动物：选取36只3～4个月龄的健康新西兰兔，体质量约3.0 kg，购买自大连医科大学动物实验中心。

1.2 实验试剂及仪器：DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、二氧化碳培养箱。

1.3 骨髓间充质干细胞的分离与体外培养：BMSCs的分离与体外培养采用密度梯度离心法，具体参见穆晓红等[5]研究方法。

1.4 关节软骨脱细胞基质的制备：关节软骨脱细胞基质的制备主要利用冷冻干燥、化学去污剂等方法制备脱细胞的兔关节软骨，具体参见武天佑等[6]文献中所用方法。

1.5 BMSCs和关节软骨脱细胞基质体外复合培养：BMSCs和关节软骨脱细胞基质体外复合培养根据杨强等[7]研究中所用方法进行。

1.6 制备兔软骨缺损模型：通过耳缘静脉注射方法麻醉所选取的36只新西兰兔，用直径为5 mm的钻孔仪在兔股骨踝关节面钻2～3 mm深的孔，制备兔双侧膝关节软骨缺损模型。

1.7 实验分组及移植方法：将所制备的36只软骨缺损模型的新西兰兔随机分成3组，每组各12只，分别进行3种不同的处理：第Ⅰ组兔软骨缺损部位移植培养好的骨髓间充质干细胞和关节软骨脱细胞基质复合物；第Ⅱ组移植单独的关节软骨脱细胞基质；第Ⅲ组不做任何移植处理。在手术后4、8、12周分别处死4只新西兰兔，取双侧膝关节组织，然后通过免疫组织化学的方法进行染色，并观察缺损组织的修复情况。

1.8 统计学分析：实验结果参照Sellers关节软骨组织学评分标准进行评分，并利用SPSS13.0分析各实验组间是否存在显著性差异。数值均以平均值±标准差表示，统计学分析采用t检验，P＜0.05表示具有显著性差异。

2 结 果

2.1 实验用新西兰兔统计：本研究选取36只3～4个月龄的健康新西兰兔，随机分为3组，每组12只，整个实验过程中无意外死亡或损失，全部计入结果分析。

2.2 体外分离及培养骨髓间充质干细胞：常规方法分离培养兔骨髓间充质干细胞，并利用免疫染色的方法鉴定了骨髓间充质干细胞，发现BMSCs特异性高表达抗原CD44，而不表达层粘连蛋白和CD34，表明我们分离机培养的骨髓间充质干细胞是正确的。

2.3 制备关节软骨脱细胞基质的支架材料，并研究其特性：Massion染色结果可见关节软骨脱细胞基质中存在很多的软骨陷窝且其周围存在大量的胶原纤维。扫描电镜观察发现脱细胞基质中没有残存的细胞器或细胞核，表明脱细胞基质的分离非常干净。

2.4 观察并评估BMSCs和关节软骨脱细胞基质的复合物对兔软骨缺损的修复效果：对3组新西兰兔进行移植处理后首先观察其运动状态和健康情况，发现经过手术处理的兔子刚开始很少运动，但随着时间不断地进行自我恢复后，其运动情况逐渐恢复正常，步态姿势正常且术后2周左右基本恢复健康。

形态学观察，发现第Ⅰ组新西兰兔在移植手术后，修复效果较好，对3组实验观察评分具体结果见表1。统计学分析发现，第Ⅰ组移植骨髓间充质干细胞复合关节软骨脱细胞基质的修复效果与第Ⅱ组单独移植关节软骨脱细胞基质和第Ⅲ组不做移植处理的空白组相比都有显著提高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组术后12周大体观察评分统计结果（

表1 各组术后12周大体观察评分统计结果（

注：*代表与第Ⅲ组比较P＜0.05，#代表与第Ⅰ组比较P＜0.05

组别表面平整填补缺损深度与正常软骨组织融合总分Ⅰ0.79±0.32*0.83±0.411.02±0.57*2.63±0.78Ⅱ1.57±0.65*1.71±0.86#1.63±0.45*4.93±1.14#Ⅲ2.45±0.872.48±0.81#2.57±0.827.85±1.23#

3 讨 论

组织工程研究的核心内容是将细胞和生物材料通过一定的方法构建成具有生命力的活体组织，进一步用重新构建的具有正常生物功能的活体组织来替换机体内相应的受损组织，并通过与周围的正常组织完整的融合来达到治疗目的，最终维持机体的正常功能。

本研究应用体外分离培养的骨髓间充质干细胞作为实验的种子细胞，用关节软骨脱细胞基质作为支架材料，在体外将骨髓间充质干细胞和关节软骨脱细胞基质通过生物医学的方法构建成具有生命力的活体组织，进而将二者形成的复合物移植到兔关节软骨的缺损部位并观察修复结果。从组织学和免疫组织化学的角度分别观察和对比了实验组和对照组，发现该复合物相比对照组而言能有效地与周围组织融合并维持兔软骨的正常代谢和功能，从而非常有效地修复兔关节软骨的损伤，这表明应用骨髓间充质干细胞复合关节软骨脱细胞基质可以用于修复兔软骨损伤。

[1] 徐敬,赵建宁,徐海栋,等.关节软骨损伤修复研究进展[J].临床与病理杂志,2015,35(3):455-461.

[2] 阮征,尹庆水,张余.关节软骨损伤修复技术的研究与进展[J].中国组织工程研究,2014(29):4724-4729.

[3] 王岩,李德华.骨髓间充质干细胞复合多肽凝胶及成软骨生成因子修复兔关节软骨缺损[J].中国组织工程研究,2015,19(1):30-36.

[4] 张志勇.转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化的研究[D].大连:大连医科大学,2009.

[5] 穆晓红,赵子义,徐林,等.密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞的分化能力[J].中国组织工程研究,2011,15(27):4955-4958.

[6] 武天佑,夏亚一,王栓科,等.关节软骨脱细胞支架材料的制备[J].中国组织工程研究,2007,11(18):3601-3603.

[7] 杨强,彭江,卢世璧,等.软骨脱细胞基质多孔支架与骨髓基质干细胞体外构建组织工程软骨的研究[J].中华医学杂志,2011,91 (17):1161-1166.

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B

1671-8194（2017）22-0053-02