骨形成因子7的分子功能研究进展及在老年医学中的应用

屈彦纯 王爱香 郭嘉宁 王珈南 杨 阔 杨 泽

骨形成因子7的分子功能研究进展及在老年医学中的应用

屈彦纯1王爱香1郭嘉宁1王珈南1杨 阔1杨 泽2

骨形成因子属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族中的一个亚群，BMP7是骨形成因子家族的一个成员，天然hBMP-7存在同源和异源二聚体形式，二聚体形式的hBMP-7是其生物学活性主要形式。糖尿病肾病和前列腺癌是两种常见的老年疾病，近年来发现BMP7是一个重要的功能性生物活性分子和疾病标志物，在糖尿病肾病、前列腺和乳腺肿瘤等领域均扮演重要的角色并发生表达变化。本文结合国内外最新研究进展，综述了BMP7的功能、信号调控和体外表达及其在糖尿病肾病等老年疾病中的应用。

BMP7 糖尿病肾病 前列腺癌 基因表达 信号调控

骨形成因子7(BMP7)是TGF-β超家族的一员。研究发现BMP7在多种生理功能和相关老年疾病发生发展中具有重要的作用，尤其在糖尿病肾脏损伤保护中是一个关键因素。通过重组BMP7的人工表达，可以有效逆转高糖肾脏损伤，并促使其恢复正常的肾脏功能。近年研究发现BMP7在乳腺癌和前列腺癌的发生进展中异常表达，对这些重要疾病的进展发挥重要的调控作用[1～6]，其中前列腺癌是影响老年男性生存和健康最重要的疾病之一。近年来BMP7已经成为重要的标志分子和候选治疗靶点，它的人工表达、功能和信号调控的研究取得了一系列最新进展。

1. BMP7的结构和生物学功能

骨形成因子蛋白是属于转化生长因子-β超家族的一类分泌型信号分子，他们诱导骨形成，在组织胚胎发育、细胞的生长、分化、迁移凋亡中具有关键作用。BMP信号传递复杂且涉及多个步骤。BMP信号通过Ⅱ型或Ⅰ型受体引发复杂的信号途径，导致Smad1活化和BMP调节基因的转录。越来越多的证据表明BMP家族不同成员活性有所差异。例如BMP2和BMP7仅有约60%的氨基酸序列同源性且转导非常不同的下游信号事件。成熟的BMP7由前体的多肽产物经酶水解后，两条含139个氨基酸组成的多肽链经二硫键结合后形成的同源二聚体糖蛋白组成，分子量约为35000，其空间结构形似“手掌”。TGF-β超家族成员的受体均包括Ⅰ型和Ⅱ型两种受体，属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体家族，BMP7受体也包括Ⅰ型和Ⅱ型两种受体，Ⅰ型受体包括ActRI，BMPR-IA和BMPR-IB，Ⅱ型受体包括ActRII，ActRIIB和BMPRII。研究表明BMP7在糖尿病肾脏损伤中具有重要的保护作用，能够保护足细胞等免受高糖刺激的损伤。间充质干细胞通过分泌BMP7抑制TGF-β信号改善糖尿病肾小球纤维化[7]。还发现BMP7可通过抑制包括p38和p44/42 MAPK在内的氧化应激和多炎症信号通路因子减弱糖尿病肾病中的小管炎症前反应[8]。Muthukrishnan等发现JUN受到BMP7调节，而其伴侣FOS受到FGF9的调节，并证实BMP7和FGF9协同调节AP-1转录，从而促使G1-S细胞周期转化和肾单位祖细胞增殖[9]。Hiroyuki Otani等研究发现BMP6和BMP7可以在GT1-7下丘脑细胞中调节雌激素诱导的GNRH表达和分泌[10]。

近年来研究表明BMP7在前列腺癌发生发展中有重要功能，如BMP7刺激PC-3细胞的上皮-间质转化。这种刺激效应是细胞特异性的，对其他前列腺癌细胞系无此效应。BMP7也抑制了血清饥饿诱发的LNCaP和C4-2B细胞的凋亡，且BMP7的表达在前列腺癌骨转移灶中与原发肿瘤中相比显著升高。Pten敲除小鼠中前列腺肿瘤组织与正常组织相比BMP7表达显著升高，为BMP7在前列腺肿瘤发生发展中的角色进一步的证据。但是不同研究者在相同或不同的细胞中得出了并不一致的结论，表明这一领域的研究结果尚不确定[11～18]。综上所述，全面理解BMPs信号在前列腺癌中的复杂性和不同BMPs在前列腺癌中的作用，需要更多的研究进展。这些效应或为抗肿瘤效应，或为促肿瘤效应，取决于细胞类型、分化阶段和特定的BMP因子。另外亦有研究表明BMP7在前列腺癌肿瘤干细胞休眠与复苏过程中扮演着重要的调控角色[19]。

2. BMP7的信号调控和分子机制

BMP7在生物体内具有重要的生物学功能，不仅促进骨的再生，而且对肾脏高糖损伤和纤维化具有重要的保护功能。此外，其在动物发育调控和器官生成、乳腺和前列腺肿瘤的发生发展等过程中起着重要的调控功能。随着研究的不断深入，BMP7的这些重要生物学功能的信号传递和分子调控机制变得日益清楚了。BMP7生物学效应是通过与Ⅱ型受体结合，使Ⅰ型受体发生磷酸化，该信号转导过程还涉及TGF-β信号通路中的转录因子Smads，包括受体调节性Smads(Smadl，Smad5)，共同作用性Smad(Smad4)和抑制性Smad(Smad6)。磷酸化的Ⅰ型受体先作用于Smadl或Smad5羧基端末端2个丝氨酸，使之磷酸化，随后Smadl或Smad5再和Smad4结合为复合体，移到细胞核内，再作用于特定基因的启动子，引起相应的生物学效应。活化的Ⅰ型受体还可以与抑制性Smad(Smad6)结合，并对下游的信号传导进行负性调控。BMP7的内源性拮抗物有noggin，follistatin，gremlin，它们能够与BMP7结合而抑制其作用。

2.1 BMP7信号通路的分子作用机制 关于BMP7生物学功能的分子作用机制近年来已经取得了长足的进展。有研究证实外源重组BMP7处理对阻塞性肾脏损伤的保护效应主要依赖于非经典性BMP信号，可能在很大程度上通过下调CCN2表达来介导[19]。研究者发现通过BMP7抑制实验肾脏纤维化依赖于Rasal1启动子正常去甲基化相关，而这种去甲基化的过程是通过Tet-3介导的羟甲基化特异性实现的[20]。而且发现肾脏淋巴循环阻断可以通过TGFβ1/Smads和BMP7/Smad5信号通路调节引起上皮细胞表型改变及管壁完整性破坏[21]。研究者还发现BMP7等可以通过抑制P38 MAPK信号通路，下调类固醇硫酸酯酶表达，从而抑制雌激素诱导的乳腺癌细胞有丝分裂增殖[22]。突变体研究表明BMP7突变体内VEGFa的表达升高导致了上皮-间质转分化异常和心脏外流系统的先天性缺陷。BMP7正是通过调控受体磷酸化激活SMAD信号通路结合于VEGFa染色质，与miR-17-92相互协同，从而阻遏并调控VEGFa的正常表达，实现心脏发育的正常调控[23]。TRPS1被发现是BMP7下游的一个重要肾脏发育调控因子，TRPS1缺乏的肾脏Pax2和Wt1水平较低，表明TRPS1缺乏影响基质向肾小泡分化。在培养肾基质细胞中，BMP7诱导TRPS1和E-cadherin表达，且下调vimentin的表达。TRPS1敲低可以抑制BMP7介导的基质上皮转分化。总之，TRPS1调控基质-上皮转分化和输尿管芽分枝，对肾单位的正常发育有重要作用[24]。在LβT2细胞中发现二类受体ActRII而不是BMPRII参与BMP诱导的FSHβ转录调节，BMP7可以抑制GnRH诱导的MAPK磷酸化。因而，BMP7和BMP6对于增强GnRH诱导的FSHβ转录的差异在于BMP配体对于GnRH诱导的ERK信号效应差异。而且，GnRH可以降低Smad1/5/8磷酸化，但增加Smad6/7表达[25]。

2.2 BMP7自身表达的分子调控机制 随着BMP7信号通路的逐渐明朗，其自身的表达调控机制也受到越来越多的关注。通过基因扩增分析发现BMP信号可以激活一系列Notch调节的转录因子，其中包括HEY1。而在另一生物系统中发现HEY1是近曲小管BMP2表达的一个负反馈调节因子[26]。另一项研究通过基因敲除发现一个BMP7结合的分泌因子CV2可以使BMP7的肾脏发育调控信号放大，而这种促进作用是通过与另一个BMP7结合因子Tsg协同作用实现的[27]。研究者还发现GPR54可以通过NFAT2和SP1调节BMP7的表达，从而对胚胎肾的发生和肾小球发育具有重要的调控作用[28]。另一发现显示Grg4能够强有力地激活BMP7报告基因的表达，且增强并维持BMP7诱导的内源Id1，BMP7不影响内源Grg4的表达，且未增强受体激活的SMAD蛋白磷酸化。Grg4表达降低了内源抑制性SMAD7的水平，因而加强了通过BMP响应序列的转录应答。这些结果表明了一个通过改变激活与抑制性SMAD蛋白比例而减弱BMP信号的新机制[29]。

2.3 微小RNA参与了BMP7信号的分子调控 随着对Mic-RNA研究的不断深入，发现BMP7的功能介导和表达调控也需要很多Mic-RNA的参与。Long等发现miR-22敲除的组织细胞中BMP6/7及其下游因子表达上升，肾脏纤维化减弱。这种表型可以通过转染miR-22类似物逆转，而且发现miR-22和BMP6/7在一个反馈环路上。miR-22不仅抑制BMP6/7的表达，且其自身表达受到BMP6/7的诱导，在miR-22启动子附近区域已经鉴定了两个BMP6/7响应元件[30]。研究者还发现EBV病毒编码的miR-155能够靶向结合包括SMAD1，SMAD5，HIVEP2，CEBPB，RUNX2和MYO10等BMP信号通路诸多因子的3’非翻译区，从而导致BMP诱导的ID3表达受到抑制。BMP介导的EBV在EBV宿主细胞B细胞系的重新激活也受到了抑制。而且，miR-155在肺上皮细胞系A549中抑制SMAD1和SMAD5的表达，它抑制BMP介导的周期依赖激酶抑制子P21的诱导，且使BMP介导的细胞生长抑制反转。这表明miR-155在控制BMP介导的细胞过程、调控BMP诱导的EBV再活化以及在正常和感染细胞中BMP信号抗肿瘤效应的抑制过程中具有重要的作用[31]。

3. BMP7的体外表达

随着基因重组和蛋白体外表达技术的快速发展，一些重要生物活性因子的体外表达已经受到人们的重视。BMP7的体外表达和生物活性也得到了广泛深入地研究。当前BMP7的体外表达体系主要有原核表达体系和真核表达体系两种。原核表达以大肠杆菌的基因工程菌为表达宿主，具有操作简单、蛋白表达量大等优点，但表达的BMP7蛋白多以包涵体存在,没有经过真核生物的表达后蛋白修饰程序，不具有生物学功能与活性。为避免原核表达体系的上述不足，近年来又发展了以慢病毒感染哺乳动物细胞为代表的真核生物表达体系，这种表达体系具有完备的真核生物翻译后修饰加工体系，能够产生具有生物活性的功能蛋白。近年来随着真核表达体系的日臻完善，许多研究者又对BMP7的表达体系做出了进一步的发展完善。Bethany等利用蛋白结构信息，设计产生了一系列BMP7蛋白突变体，不仅提高了其在哺乳动物细胞中的表达水平，也改善了BMP7蛋白在中性pH下的溶解性，同时还限定了成熟蛋白的氨基端杂合性。这些突变在不降低BMP7的体外生物活性的前提下，很大程度上提高了BMP7重组蛋白的临床药用价值[32]。Halcsik等在人的293T细胞中通过慢病毒转染表达了人的重组BMP7蛋白。正常分泌的二聚体重组蛋白可以被BMP7抗体识别，具有糖基化修饰，且通过体内外实验分别证实了纯化蛋白的骨再生活性和碱性磷酸酶活性，结果表明此表达体系可以作为医用人细胞因子及其他蛋白的重组表达平台[33]。Chitty等采用第三代慢病毒基因转移体系发展了一种表达BMP7的人类细胞。他们将第三代慢病毒载体转入HEK293等细胞株，结果表明至少在转染4周内可以产生BMP7蛋白，并分别通过酶联免疫法、SMAD磷酸化和神经细胞分化活性证实了BMP7蛋白的生物活性和功能。此外，脑室内注射慢病毒载体也可以导致BMP7蛋白异位表达于神经元或星形胶质细胞。这种基因转移系统为将来的体内外研究提供了可靠的BMP7功能蛋白的来源[34]。Sathyamurthy等通过在CHO-BMP7细胞中过表达一种可溶性配对碱性氨基酸剪切酶有效促进了BMP7前体形式的加工，且并未显著影响细胞的生长。这种系统使BMP7成熟蛋白产率接近100%，且免除了去除前体形式的下游纯化负担，使这项BMP7重组蛋白提取技术进一步成熟[35]。

BMP7是目前研究较为深入的重要细胞生长因子之一，已经在肾脏高糖损伤保护与前列腺肿瘤发生进展及其调控等老年疾病中获得了广泛深入的研究。它不但可以作为肾脏高糖损伤靶向治疗的重点候选生物活性因子，而且在前列腺癌肿瘤干细胞的休眠与复苏过程中有重要的调控作用。随着进一步的深入研究其表达调控和作用分子机制将更加清楚。进一步提高人工表达重组蛋白的产量并通过表达载体和宿主细胞的人源化使其更加接近内源活性BMP7蛋白因子，从而为新型靶向治疗药物的开发奠定基础，是未来的重要努力方向。

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The Advancement of Studies on the Molecular Function and of Bone Morphogenetic Protein 7 and its Role in Geriatrics

(QUYanchun1,WANGAixiang1,GUOJianing1,WANGJianan1,YANGKuo1,YANGZe2.1.TianjinInstituteofUrology,theSecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211; 2.Beijinghospital,Beijing100730,P.R.China.)

Bone morphogenetic proteins are a subgroup of transforming growth factor-β(TGF-β) super-family.BMP7 is a member of Bone morphogenetic protein family.Natural human BMP7 is present as heomo or hetero dimer.Dimmer is the main form of active human BMP7.Diabetic nephropathy and prostate cancer are two common geriatric disorders.It was found recent years that BMP7 was an important functional bioactive molecule and disease marker and play a key role in some geriatric disorders such as diabetic nephropathy,tumor in prostate or breast.Its expression is changed markedly during the development of above disorder.Here the latest advancement of the function and signal regulation and in vitro expression,as well as its use in Geriu’;,m atrics was summarized.

Bone morphogenetic protein 7, Diabetic nephropathy, Prostate cancer, signal modulation.Financial support: the Tianjin Overseas Returnees Start-up Fund (TJ2016-038)

1.天津医科大学第二医院，天津市泌尿外科研究所 300000 2.北京医院，国家老年医学中心，卫生部老年医学重点实验室 100730

天津留学回国人员启动基金(TJ-2016-038)

10.3969/j.issn.1672-4860.2017.04.002

2017-7-8