纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞影响的体外实验研究

吴平平

【摘要】 目的 探討纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞的影响。方法 采用溶剂挥发法制备共载中药甘草酸（GA）及化疗药物柔红霉素（DNR）的纳米囊， 将其分为P-gp Ab修饰共载中药GA及化疗药物DNR组（A组）；P-gp Ab修饰装载DNR化疗药物组（B组）；DNR化疗药物组（C组）；DNR+GA组（D组）；P-gp Ab修饰纳米囊空载组（E组）；GA组（F组）；生理盐水对照组（G组）。采用体外四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法评价细胞毒作用（白血病多药耐药细胞K562/A02）， 采用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况， 采用化学发光自显影免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达。结果 A组的K562/A02的半抑制浓度指数（IC50）为（3.65±1.06）， 其降低效果优于其他组（P<0.05）。B组IC50为（3.12±0.96）， 低于C、D、F组的（0.95±0.04）、（0.96±0.03）、（0.94±0.05）（P<0.05）。C、D、F组的耐药指数（RE）均接近1， 故认为对K562/A02的细胞无增强耐药作用， 也无毒性作用。E组和G组为对照组， 检测到的细胞掉凋亡率较小， 不计入比较。A组的细胞总凋亡率高于其他各组（P<0.05）。B组的细胞凋亡率高于C、D、F组（P<0.05）。A组的Bcl-2的表达低于其他各组， Bax的表达高于其他各组（P<0.05）。E组和G组的Bcl-2表达均高于其他各组， Bax的表达均低于其他各组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论 纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞具有细胞毒性， 中药GA+化疗药物DNR具有明显的协同效果， 其作用机制可能与上调Bax表达与下调Bcl-2有关。

【关键词】 纳米囊制剂；白细胞；多药耐药；K562/A02；体外实验

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.23.002

In vitro experimental study of effects of nanocapsules on multidrug resistance of leukemia cells WU Ping-ping. Department of Internal Medicine-Oncology， Jiangsu Province Tumor Hospital， Nanjing 210009， China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of nanocapsules on multidrug resistance of leukemia cells. Methods Nanocapsules containing Chinese medicine glycyrrhizin （GA） and chemotherapy drug daunorubicin （DNR） were prepared by solvent evaporation method. They were divided into P-gp Ab modified loading traditional Chinese medicine GA and chemotherapy drug DNR group （group A） and P-gp Ab modified loading DNR chemotherapy group （group B）， DNR chemotherapy drug group （group C）， DNR+GA group （group D），

P-gp Ab modified nanocapsules empty group （group E）， GA group （group F） and saline control group（group G）. The cytotoxicity （leukemia multidrug resistance cell K562 / A02） was evaluated by methylthio tetrazole （MTT） colorimetric assay， apoptosis was detected by flow cytometry， and the expression of B-cellymphoma-2 associated X protein （Bax） and B-cellymphoma-2 （Bcl-2） were detected by chemiluminescence autoradiography （Western Blot）. Results Group A had semi inhibitory concentration index （IC50） of K562/A02 as （3.65±1.06）， and its reduction effect was better than the other groups （P<0.05）. Group B had IC50 as （3.12±0.96）， which were lower than （0.95±0.04）， （0.96±0.03） and （0.94±0.05） in group C， group D and group F （P<0.05）. The resistance factor （RI） of group C， D and F was close to 1， so it was considered that the K562/A02 cells had no enhanced drug resistance and non-toxic effect. Group E and group G as the control group， their detected cell outage rate was small， so they were not included in the comparison. Group A had higher total cell apoptosis rate than the other groups （P<0.05）. Group B had higher cell apoptosis rate than group C， group D and group F （P<0.05）. Group A had lower expression of Bcl-2 than the other groups， and higher expression of Bax than the other groups （P<0.05）. Group E and group G had higher expression of Bcl-2 than the other groups， and lower expression of Bax than the other groups. Their difference was statistical significant （P<0.05）. Conclusion Nanocapsules can be cytotoxic to leukemia multidrug resistance cells， and the Chinese medicine GA+ chemotherapy drug DNR has obvious synergistic effect， and its mechanism may be related to up-regulation of Bax expression and down-regulation of Bcl-2 expression.

【Key words】 Nanocapsules； White blood cell； Multidrug resistance； K562/A02； In vitro experiment

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病， 其原因不明， 发病率居恶性肿瘤的第六位。化疗是治疗白血病的首选治疗方法， 但由于肿瘤多药耐药性现象的出现， 化疗失败以及难治性白血病时有发生。寻找低毒高效的白血病多药耐药逆转剂已经成为当前研究的热点。纳米粒是一种新型的药物载体系统， 其能改变药物在人体内的分布， 可延长药物的作用时间 [1]。本研究旨在纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞的影响， 以期为白血病的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1. 1 细胞株 白血病多药耐药细胞K562/A02（中国医学科学院血液学研究所提供）。

1. 2 试剂与仪器

1. 2. 1 主要试剂 IMDM培养基， 胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）， 实时荧光定量检测试剂盒（武汉博士的生物制药有限公司）， 兔抗人P-gp抗体（Abcam， 美国）， B淋巴细胞瘤-2基因、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白上下引物（上海英维捷基有限公司）， 二甲基亚砜（DMSO， Sigma， 纯度>99%， 美国）， MTT（AMRESCO， 美国）， 细胞计数试剂盒（日本同仁公司）等。

1. 2. 2 主要仪器 电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）， 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）， 荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad 公司， CFX96型）， 倒置生物显微镜（日本尼康 TS100-F）， 冷冻离心机（美国Eppendorf 公司）， SDS 凝胶电泳槽（大连竞迈生物）等。

1. 3 方法

1. 3. 1 纳米囊制剂的制备 采用溶劑挥发法制备共载中药GA及化疗药物DNR的纳米囊， 采用差速离心分离法可对纳米囊进行不同粒径的分离和筛选， 根据实验需要收集直径<1000 nm的纳米囊溶液样品， 进行后面的实验分析和研究。戊二醛交联法构建P-gp Ab偶联纳米囊。将其分为P-gp Ab修饰共载中药GA及化疗药物DNR组（A组）；P-gp Ab修饰装载DNR化疗药物组（B组）；DNR化疗药物组（C组）；DNR+GA组（D组）；P-gp Ab修饰纳米囊空载组（E组）；GA组（F组）；生理盐水对照组（G组）。

1. 3. 2 细胞株及细胞培养 白血病多药耐药细胞K562/A02， 置于含有10% 新生牛血清的RPMI 1640（链霉素100 μg/ml、青霉素100 IU/ml）培养基中， 于含有5%二氧化碳、95%湿度的37℃培养箱中培养。

1. 3. 3 细胞毒性测定 采用MTT法[2]测定波长为540 nm， 绘制生长曲线， 计算IC50及RF。

1. 3. 4 细胞凋亡 采用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况， 取对数生长期的K562/A02细胞， 加入6孔板内， 根据分组的情况加入不同药物。培养24 h。磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次， 加入相关药物混匀后， 4℃避光保存。

1. 3. 5 Bax、Bcl-2蛋白的表达 采用Western Blot检测， 取对数生长期的K562/A02细胞， 调整细胞浓度， 收集细胞。按照常规方法裂解细胞提取总蛋白， 二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度， 将聚偏氟乙烯（PVDF）膜置于其中封闭2 h。一抗4℃过夜， 加入二抗后室温孵育 2 h， 将PVDF膜从一抗中取出TBS-T中漂洗3次， 以凝胶成像仪对条带进行成像， 用Image图像分析软件计算的灰度值。

1. 4 统计学方法 采用SPSS15.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 纳米囊制剂的细胞毒性作用 A组的K562/A02的IC50为（3.65±1.06）， 其降低效果优于其他组， 差异有统计学意义（P<0.05）。B组IC50为（3.12±0.96）， 低于C、D、F组的（0.95±0.04）、（0.96±0.03）、（0.94±0.05）， 差异有统计学意义（P<0.05）。C、D、F组的RF均接近1， 故认为对K562/A02的细胞无增强耐药作用， 也无毒性作用。

2. 2 纳米囊制剂对耐药细胞K562/A02凋亡率的影响 E组和G组为对照组， 检测到的细胞掉凋亡率较小， 不计入比较。A组的细胞总凋亡率高于其他各组， 差异有统计学意义（P<0.05）。B组的细胞凋亡率高于C、D、F组， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 3 纳米囊制剂对耐药细胞K562/A02细胞Bax、Bcl-2的表达的影响 A组的Bcl-2的表达低于其他各组， Bax的表达高于其他各组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。E组和G组的Bcl-2表达均高于其他各组， Bax的表达均低于其他各组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

多药耐药可导致机体对化疗药物的敏感性较低， 是白血病化疗失败和复发的重要原因， 已经成为临床上亟待解决的问题。多药耐药的作用与酶转移系统、膜转运蛋白， 抗凋亡通路激活和抗凋亡基因表达有关。细胞凋亡受到细胞内凋亡调节蛋白的调控， 该类蛋白分为两种， 促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。当两种蛋白比例失衡时容易引发细胞凋亡[3， 4]。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白， 通过其编码的Bcl-2蛋白而发挥抑制细胞凋亡的作用。Bax是一种抗凋亡蛋白， 其表达水平增高时责促进细胞凋亡。细胞内Bax/Bcl-2决定细胞是生存还是凋亡。通过药物干预凋亡相关基因的表达， 调控细胞内信号传导途径， 以减少细胞凋亡， 可能会成为克服多药耐药医学难题的重要突破点。

本研究采用纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞进行干预结果发现， P-gp Ab修饰共载中药GA及化疗药物DNR对耐药菌株K562/A02细胞毒性较强， 能够显著促进细胞凋亡， 效果均好于化疗DNR+中药组、单纯中药组、单纯化疗DNR组以及P-gp Ab修饰装载DNR化疗药物组， 差异均有统计学意义。纳米粒子是指粒度在1～100 nm之间的粒子， 粒径小且分布窄， 容易穿过生理屏障， 达到药物本身无法到达的地方， 并具有缓、控释作用， 不仅药物作用时间长， 而且可主动达到鞭向部位[5， 6]。纳米载体治疗已经成为抗肿瘤药物的新兴热点， 其无论单方药还是复方药均可包载。中药逆转白血病多药耐药的作用已经陆续被报道， 其可增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性， 抑制外排泵ABC转运蛋白表达逆转肿瘤多药耐药性[7， 8]。本研究采用P-gp Ab修飾共载中药GA及化疗药物DNR对白血病耐药菌株K562/A02的逆转效果好。

综上所述， 纳米囊制剂对白血病多药耐药细胞具有细胞毒性， 中药GA+化疗药物DNR具有明显的协同效果， 其作用机制可能与上调Bax表达与下调Bcl-2有关。

参考文献

[1] 刘苒. 转铁蛋白修饰的新型多聚物载药纳米粒的研制及靶向逆转白血病多药耐药的体外研究. 东南大学， 2015.

[2] 李秀军， 姚宇红， 严鲁萍. 干扰素对白血病多药耐药细胞HL60/VCR的影响. 广东医学， 2014（12）：1836-1837.

[3] 李秀军， 姚宇红， 严鲁萍. 干扰素对白血病多药耐药细胞HL60/VCR的影响// 中西医结合血液高峰论坛， 2014：1836-1837.

[4] 林婷， 廖斌， 徐成波， 等. 中药复方君子汤联合阿霉素逆转白血病K562/VCR细胞多药耐药及诱导凋亡的机制研究. 广州中医药大学学报， 2017， 34（1）：95-100.

[5] 廖斌， 葛仁英， 徐成波， 等. 中药复方君子汤对白血病细胞株K562/VCR耐药性的逆转作用. 康复学报， 2011， 21（4）：9-12.

[6] 何玉芳. 川芎嗪主动靶向纳米粒逆转肿瘤细胞多药耐药作用研究. 大连医科大学， 2013.

[7] 刘向阳. 多肽壳聚糖川芎嗪纳米粒逆转肿瘤细胞耐药作用研究. 大连医科大学， 2016.

[8] 吴玉强， 薛文翰. 中药逆转白血病细胞多药耐药的研究进展. 甘肃医药， 2016， 35（4）：267-269.

[收稿日期：2017-05-19]