太原市冬夏季PM2.5亚慢性染毒对大鼠肺炎症因子和CK-18表达的影响

李瑞金,张玫,赵利芳,王影,苏瑞军,刘小娜,李卓玉

(山西大学 环境科学研究所 生物技术研究所,山西 太原 030006)

太原市冬夏季PM2.5亚慢性染毒对大鼠肺炎症因子和CK-18表达的影响

李瑞金,张玫,赵利芳,王影,苏瑞军,刘小娜,李卓玉

(山西大学 环境科学研究所 生物技术研究所,山西 太原 030006)

研究采集PM2.5样本,制备PM2.5生理盐水混悬液，对雄性SD大鼠进行染毒实验，检测大鼠肺组织病理学改变,测定肺中炎症因子和CK-18 mRNA和蛋白表达。结果显示,随着PM2.5染毒剂量增加,肺组织出现肺充血和炎性细胞浸润等炎症反应,冬季PM2.5所致肺病理学损伤比夏季严重。冬季PM2.5中、高剂量组和夏季高剂量组大鼠肺中TNF-α、IL-6、TGF-β、CK-18 mRNA和蛋白表达比对照组显著增加。这说明PM2.5亚慢性染毒可增加炎症因子表达水平,促进肺炎症反应。CK-18表达上调提示PM2.5致肺组织处于氧化应激状态。太原市冬季PM2.5引起大鼠肺炎症损伤效应比夏季严重。

细颗粒物;大鼠;肺;炎症因子;细胞角蛋白18;亚慢性染毒

0 引言

细颗粒物(PM2.5)是常见的大气污染物,也是雾霾形成的主要因素,主要来源于燃料燃烧、机动车尾气排放、工业和建筑粉尘等。PM2.5可随人体呼吸进入肺泡和血液中,且富含重金属和多环芳烃等多种有毒有害物质,暴露时间长,对人体健康有不良影响。研究表明,PM2.5暴露引起肺部组织结构改变、肺功能下降及炎症,与肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌的发生有关[1-2]。

炎症是机体对于刺激的一种防御反应,也是疾病的发病基础。细胞因子作为炎症反应的参与者,发挥了重要作用。肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素细胞6(IL-6)是重要的促炎细胞因子[3],转化生长因子(TGF-β)同时具有抗炎和促炎效应,其作用涉及它与其他细胞因子的相互作用及抗炎和促炎效应的平衡[4-5]。细胞角蛋白18(CK-18)主要分布于上皮细胞,在保护细胞结构稳定性中发挥作用[6],与氧化应激、细胞凋亡和炎症有关[6-8],是哮喘和肺纤维化的生物标志物[9-10]。动物和细胞实验表明,PM2.5能增加IL-6和TNF-α分泌,促进炎症反应[11-12],然而,PM2.5亚慢性染毒对肺抗炎因子和CK-18水平的影响报道较少。考虑到PM2.5的来源、组成和理化特性具有明显的地域性和季节性,本研究采集太原市冬、夏季大气PM2.5,提取颗粒物并制备PM2.5生理盐水混悬液,采用气道滴注方式进行大鼠PM2.5暴露染毒,建立动物亚慢性染毒模型,观察大鼠肺组织促炎因子TNF-α/IL-6、抗炎因子TGF-β及CK-18mRNA和蛋白表达变化,以期为PM2.5肺毒性作用机制的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 颗粒物的采集与制备

采用大气颗粒物采样器于山西大学环境与资源学院楼顶采集冬、夏季PM2.5。将PM2.5石英采样膜剪成小块浸入超纯水中,超声处理,经纱布过滤,收集PM2.5溶液,真空冷冻干燥得到干粉,以灭菌生理盐水配制成不同浓度的PM2.5混悬液。

1.2 实验动物分组与染毒方法

健康清洁级雄性SD大鼠购于北京中国人民解放军事医学科学院实验动物中心,体重为220～240 g,饲养于本研究所动物房内。将35只大鼠随机分为7组,分别为对照组(C组,生理盐水组)、3个不同剂量夏季PM2.5染毒组(0.2、0.6、1.5 mg/kg 体重,分别记为S1、S2、S3组)及3个不同剂量冬季PM2.5染毒组(0.3、1.5、2.7 mg/kg 体重,分别记为W1、W2、W3组),每组5只。采取气道滴注法,隔2天对大鼠染毒1次,时间为60天。

1.3 测定指标及分析方法

最后一次滴注24 h后,麻醉处死大鼠,取肺组织,一部分用于甲醛固定、石蜡包埋和苏木精-伊红(HE)染色;其余迅速冻于液氮,随后在-80℃中贮存,备用。用Trizol提取大鼠肺总RNA,采用反转录试剂盒(北京全式金生物科技)形成第一链成cDNA,然后于荧光定量PCR仪进行qPCR分析。实验所用的引物分别为:GADPH(F:5′-ATGTATCCGTTGTGGATCTGAC-3′;R:5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′,78bp)TNF-∂ (F:5′-ACAGAAAGCATGATCCGAGA-3′;R:5′-TCAGTAGAGAGAAGAGCGTGG-3′,148bp)IL-6(F:5′-TCCTACCCCAACTTCCAATGCTC-3′;R:5′-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3′,79bp)TGF-β(F:5′-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3′;R:5′-TGGGACTGATCCCATTGATT-3′,146bp)CK-18(F:5′-AAGGCCTACAAGCCCAGATT-3′;R:5′-CACTGTGGTGCTCTCCTCAA-3′,179bp)。mRNA表达以目标基因/内参GADPH相对定量。同时,采用ELISA试剂盒(上海西唐生物科技)测定大鼠肺组织匀浆上清液中TNF-α、IL-6、TGF-β、CK-18的水平。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 数据的统计学处理

实验数据均以平均值±标准差(Mean±SD)表示,应用SPSS19.0软件对数据结果进行单因素方差分析-最小显著性差异法(LSD)检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺病理学研究结果

从图1可知,对照组和低剂量PM2.5(0.2和0.3 mg/kg)组大鼠肺组织结构正常(见C和W1,S1未附图),0.6 mg/kg PM2.5作用下,肺组织出现充血现象(S2);随着剂量增加,病理学现象逐渐加重,伴有不同程度的充血、炎性细胞浸润等炎症反应和支气管上皮细胞增生现象(S3,W2,W3)。

Fig.1 Results of HE staining in rat lungs exposed to PM2.5 (Red arrow:hyperemia; yellow arrow:inflammatory cell infiltrate; blue arrow:bronchial epithelial hyperplasia)图1 PM2.5对大鼠肺组织作用后HE染色结果(红箭头所指位置:充血;黄箭头所指位置:炎性细胞浸润;蓝箭头所指位置:支气管上皮细胞增生)

2.2 PM2.5对大鼠肺组织TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达影响

Fig.2 Effect of PM2.5 on TNF-α and IL-6 mRNA (A) and protein (B) expression in rat lungs (compared with the control,*P<0.05)图2 PM2.5对大鼠肺组织TNF-α、IL-6 mRNA(A)和蛋白(B)表达的影响(与对照组相比,*P<0.05)

不同浓度冬、夏季PM2.5处理大鼠后,肺中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达变化如图2所示。由图2可知,冬季低剂量及夏季中、低剂量PM2.5处理后的大鼠肺组织中的TNF-α、IL-6表达虽均有增加,但与对照组相比差异不显著(P>0.05)。冬季中、高剂量组及夏季高剂量组PM2.5处理后大鼠肺中上述基因mRNA表达水平均显著上升,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);冬、夏高剂量组PM2.5处理后大鼠肺中TNF-α、IL-6基因蛋白表达均上升,与对照组相比有显著性(P<0.05);且TNF-α、IL-6基因表达有剂量-效应关系(R2>0.92)。

2.3 PM2.5对大鼠肺组织TGF-β mRNA和蛋白表达影响

Fig.3 Effect of PM2.5 on TGF-β mRNA and protein expression in rat lungs(compared with the control,*P<0.05,**P<0.01)图3 PM2.5对大鼠肺组织TGF-β mRNA和蛋白表达的影响(与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01)

由图3可知,与对照组相比,只有冬季中、高剂量及夏季高剂量PM2.5处理后大鼠肺中TGF-β mRNA表达都显著增加,且有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)。冬季中、高剂量及夏季高剂量PM2.5处理后,大鼠肺中TGF-β蛋白表达对照组显著增加(P<0.05),而其他组TGF-β蛋白表达与对照组相比无显著性差异。冬季和夏季PM2.5处理后,TGF-β mRNA和蛋白表达随着剂量的增加而增加(R2>0.95)。

Fig.4 Effect of PM2.5on CK-18 mRNA and protein expression in rat lungs (compared with the control,*P<0.05,**P<0.01)图4 PM2.5对大鼠肺组织CK-18 mRNA和蛋白表达的影响(与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01)

2.4 PM2.5对大鼠肺组织CK-18 mRNA和蛋白表达影响

不同浓度冬、夏季PM2.5暴露后,大鼠肺中CK-18 mRNA和蛋白表达情况如图4所示。与对照组相比,冬季中、高剂量及夏季高剂量PM2.5组处理后大鼠肺中CK-18 mRNA基因表达均明显升高,冬季高剂量PM2.5组处理后大鼠肺中CK-18蛋白表达显著升高,且有差异显著(P<0.05或P<0.01);且冬、夏季PM2.5引起CK-18基因表达有剂量-效应关系(R2>0.93)。

3 讨论

PM2.5是我国主要的大气污染物,也是一种呼吸系统毒物[13]。近年来,我国华北地区出现了严重的雾霾天气,其发生与高浓度PM2.5有关,已严重影响了人们的身体健康和生活质量。PM2.5肺毒性作用机制研究更被人们关注。

TNF-α和IL-6可促进炎性细胞浸润,是机体早期炎症反应的敏感指标,在炎性发展中起重要作用[3]。研究发现,PM2.5可引起出租车司机血清和大鼠肺及肺泡巨噬细胞中TNF-α和IL-6水平升高,与本研究结果一致[11-12,14]。有文献表明TGF-β具有抗炎作用[4]。本研究结果显示,较高剂量PM2.5染毒引起TGF-β mRNA和蛋白表达量对照组显著增加,提示肺组织受到PM2.5作用后启动了抗炎机制。从本研究的肺病理学结果看,PM2.5亚慢性暴露引起肺组织炎症损伤,这反映出PM2.5引起的促炎反应占据主导地位,抗炎反应较弱,出现了持续的炎症反应。值得关注的是,有研究表明,TGF-β能通过信号调节途径上调IL-6的表达[15],结合本研究中PM2.5上调了TGF-β与IL-6表达的结果,我们推断在TGF-β抗炎作用小于促炎因子时,它会与促炎因子共同作用引起肺致炎反应,进而造成肺损伤。

CK-18是一种中间丝蛋白,参与维持细胞骨架结构。CK-18基因变化会破坏中间纤维结构,影响细胞微骨架结构的稳定性[16]。CK-18又是一种应激蛋白,能够参与细胞中的活性氧(ROS)水平调节。在细胞处于氧化应激状态时,CK-18水平上调。据文献报道,IL-6能显著上调肠上皮细胞CK-18 mRNA和蛋白表达[17],说明除维持细胞结构稳定和抗氧化外,CK-18还与炎症反应有关。本文特别关注了大气PM2.5对肺CK-18表达的影响，研究发现CK-18的表达随着PM2.5暴露浓度的增加而增加,提示肺受到PM2.5胁迫后出现氧化应激状态,而氧化应激又可导致炎性细胞浸润,并产生炎症因子和细胞因子[18]。本研究发现肺组织炎性细胞浸润和促炎细胞因子水平增加,这一结果也从侧面支持了CK-18表达上调所引起的应激作用。CK-18与炎症细胞因子之间的调控关联,还需进一步研究。

太原市2012年1月到2013年1月期间,本实验大气颗粒物采样点夏季PM2.5的日平均质量浓度为148 μg/m3(49～251 μg/m3),冬季PM2.5为336 μg/m3(125～544 μg/m3),且冬季PM2.5中有机物(包括多环芳烃在内)、有机碳、元素碳和重金属的含量高于夏季。冬季PM2.5中重金属Pb、Cu、Cd浓度高,夏季Ni、Cr浓度较高[19-21]。这些研究表明冬季和夏季大气PM2.5浓度水平和成分有差异。本研究发现冬季PM2.5亚慢性染毒引起大鼠肺组织病理学损伤比夏季PM2.5严重，同时还发现,0.6 mg/kg 体重PM2.5滴注浓度下(根据夏季PM2.5139 μg/m3暴露水平和大鼠3天呼吸量计算),大鼠肺炎症因子和CK-18基因表达变化与对照组相比差异不显著(P>0.05);1.5 mg/kg 体重PM2.5滴注浓度下(相当于夏季或冬季PM2.5350 μg/m3的暴露水平)下,大鼠肺炎症因子和CK-18基因表达上调比对照组有显著性差异(P<0.05)。结合实验结果,并考虑到太原市夏季PM2.5最高浓度为251 μg/m3,冬季PM2.5平均浓度为336 μg/m3、最高浓度为544 μg/m3,提示冬季PM2.5比夏季PM2.5引起了较严重的肺炎症损伤。

4 结论

(1)在本实验条件下,较高浓度PM2.5(1.5和/或2.7 mg/kg体重)亚慢性暴露引起大鼠肺炎症相关细胞因子(IL-6/TNF-α/TGF-β)表达上调,增加CK-18表达,导致肺病理损伤。

(2)与夏季PM2.5相比,冬季PM2.5暴露引起大鼠肺组织炎症损伤更为严重。

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Effects of Subchronic Exposure of Ambient Fine Particulate Matter in Winter and Summer in Taiyuan on Gene Expressions of Cytokines and Cytokeratin 18 in Lungs of Rats

LI Ruijin,ZHANG Mei,ZHAO Lifang,WANG Ying,SU Ruijun,LIU Xiaona,LI Zhuoyu

(Institute of Environmental Science,Institute of Biotechnology,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

PM2.5samples were sampled and PM2.5saline suspension was prepared，the male SD rats were injected with the suspension.The rats were administered using PM2.5solutions by intratracheal instillation respectively every three days enduring for 60 days. The histopathological changes and the mRNA and protein expressions of inflammatory factors and CK-18 in lung of rats were detected.The results showed that with the PM2.5dosage increasing,the lung histopathological damage was aggravated accompanied by some inflammatory responses like hyperemia and inflammatory cell infiltrate.Such the effects induced by winter PM2.5were significant compared to summer PM2.5. The mRNA and protein expressions of TNF-α、IL-6、TGF-β and CK-18 in the lung tissues in medium and high dose PM2.5groups in winter were significantly increased compared with the control group, while the expressions of the above 4 genes were significantly elevated in the high dose PM2.5group in summer compared to the control. It suggests that subchronic exposure of PM2.5induces an increase of levels of inflammatory related factors, which may enhance the inflammatory responses in lung. Up-regulation of CK-18 expression suggests that the lung is in the status of oxidative stress induced by PM2.5. The inflammatory responses in the lungs of rats caused by winter PM2.5in Taiyuan were more severe than that of summer PM2.5.

fine particulate matter;rats;lung;inflammatory factors;cytokeratin 18;subchronic exposure

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.03.030

2017-05-31；

2017-06-19

国家自然科学基金(91543202)

李瑞金(1967-),女,广西田东人,博士,教授,从事大气污染与毒理学研究。E-mail:lirj@sxu.edu.cn

R994.6

A

0253-2395(2017)03-0622-06