樱桃汁饮料中花青素的快速测定方法

安春志，王有志

（广东南华工商职业学院，广东广州510507）

樱桃汁饮料中花青素的快速测定方法

安春志，王有志

（广东南华工商职业学院，广东广州510507）

建立一种快速、有效的高效液相色谱法，测定樱桃汁饮料中芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的方法。样品经0.5%盐酸乙醇提取后，采用C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分离，以乙腈-5%磷酸梯度洗脱的条件下，用PDA检测器检测，外标法峰面积定量。结果表明，芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷标液在20.0 μg/mL～200.0 μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数r2为0.999，芍药素-3-葡萄糖苷检出限为40 mg/kg，定量限为120 mg/kg，锦葵定-3-葡萄糖苷检出限为50 mg/kg，定量限为150 mg/kg，两个目标物的加标回收率为88.4%～92.6%。该方法具有前处理简单、检测速度快的优点，适用于樱桃汁饮料中芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的定量检测。

樱桃汁；花青素；高效液相色谱

花青素（anthocyanins）又称花色素，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物[1]，多以糖苷的形式存在，植物中常见花青素的化学结构见图1。

图1 植物中常见花青素的化学结构Fig.1 Chemical structure of common anthocyanidins in plants

如图1所示，花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定的营养作用，在食品、化妆、医药等方面有着巨大的应用潜力[2-6]。花青素是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂，具有抗氧化、抗癌、促进视红素再合成等多种生理活性。樱桃中所含有的花青素十分丰富，由樱桃制成的樱桃汁饮料中也含有花青素。樱桃中一般含有的花青素是芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷这两种[7-9]，但是针对樱桃汁饮料中这两种花青素的研究较少，所以本试验针对这两种花青素来研究相应的检测方法。

目前，关于花青素的分析方法目前用得较多的是紫外分光光度法和HPLC法等[10-12]。紫外分光光度法一般测定是样品中花青素总的含量，缺点是不能确定单一组分的含量，易受到有色物质的干扰等。高效液相色谱法为现在常用的检出方法，但是在前处理的步骤上繁琐，费时，试验的成本较大。本试验在原有的高效液相色谱法的基础上，对前处理步骤进行改进，并对检测条件进行优化，能对樱桃汁饮料中芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的各个组分的含量能够做到快速、准确的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695型高效液相色谱系统、2998型PDA检测器：美国Waters；芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷标准品：国家标准物质中心。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：25 ℃。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件的优化

固定流动相流速1.0 mL/min，配制不同体系的流动相体系，流动相Ⅰ：甲醇-5%磷酸溶液（体积比为25∶75）；流动相Ⅱ：甲醇-5%乙酸溶液（体积比为 25∶75）；流动相Ⅲ：乙腈-5%磷酸溶液（体积比为 25∶75）；流动相Ⅳ：乙腈-5%乙酸溶液（体积比为25∶75），考察4种流动相对芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷色谱行为的影响；并优化合适的洗脱模式，使得目标峰的出峰时间合适，分离度较好，峰形尖锐、对称。

1.3.2 检测波长的选择

本试验采用PDA检测器进行全波长扫描（扫描范围200 nm～600 nm），根据芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷标准品的响应值，选择比较合适的检测波长。

1.3.3 标准曲线的制作

称取相应质量的芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷标准品，配制成浓度为 20.0、40.0、80.0、100.0、200.0 μg/mL 的标准溶液，进行仪器分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.4 样品提取溶剂的选择

根据芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的理化特点，试验比较蒸馏水、0.5%柠檬酸、0.5%盐酸、0.5%盐酸乙醇、0.5%盐酸丙三醇等5种提取溶剂的提取效果。

1.3.5 加标回收试验

以已知花青素含量的樱桃汁饮料为基质，加入芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷标准溶液，选择优化后的前处理条件操作，上机检测，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

参考相关文献 [13-15]，发现不同文献检测芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的流动相体系不同，主要分为四大类流动相体系：甲醇/磷酸溶液体系、甲醇/乙酸溶液体系、乙腈/磷酸溶液体系和乙腈/乙酸溶液体系。所以为了了解这些流动相对这芍药素-3-葡萄糖苷和锦葵定-3-葡萄糖苷色谱行为的影响，本研究固定流动相洗脱速度，配制不同体系的流动相Ⅰ：甲醇-5%磷酸溶液（体积比为25∶75）；流动相Ⅱ：甲醇-5%乙酸溶液（体积比为25∶75）；流动相Ⅲ：乙腈-5%磷酸溶液（体积比为25∶75），流动相Ⅳ：乙腈-5%乙酸溶液（体积比为25∶75）；并考虑洗脱模式对两个目标物的分离度的影响，来确定流动相及洗脱模式对芍药素-3-葡萄糖苷和锦葵定-3-葡萄糖苷色谱行为的影响。色谱条件对目标物的影响见图2。

图2 芍药素-3-葡萄糖苷（峰1）、锦葵定-3-葡萄糖苷（峰2）色谱图Fig.2 Chromatogram of peonidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside

结果表明：甲醇、乙腈在分离和保留芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷上并没有明显差别，但是考虑到乙腈洗脱能力更强，选用乙腈作为流动相体系之一。乙腈-5%磷酸溶液与乙腈-5%乙酸溶液相比，乙腈-5%磷酸溶液能更好的将样品中的杂质峰分开。

但是在乙腈-5%磷酸溶液体系下，等度洗脱的条件芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷两者的分离度不好，所以本试验进一步摸索了乙腈-5%磷酸溶液流动相梯度洗脱的条件。最终流动相洗脱条件A(乙腈)-B（5% 磷酸溶液）为 0～5.0 min、B25%；5.0 min～12.0 min、B25%～40%；12.0 min～20.0 min、B40%～25%，芍药素-3-葡萄糖苷在6.978 min出峰，锦葵定-3-葡萄糖苷在9.294 min出峰，两者能得到良好的基线分离，分离度较好，其峰型良好，出峰时间合适。

2.2 检测波长的选择

本试验采用PDA检测器对芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷进行全波长扫描（范围200 nm～600 nm）。全波长扫描图见图3。

图3 全波长扫描图Fig.3 Full wavelength scanning chart

如图3所示，两个目标物在215、515 nm附近各存在一个吸收峰。但是215 nm波长条件下干扰物质较多，所以选择515 nm作为芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的检测波长。

2.3 标准曲线的制作

为了验证芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷在流动相体系中的线性关系，配制了浓度为20.0、40.0、80.0、100.0、200.0 μg/mL 的系列标准溶液。试验结果表明，芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷在 20.0 μg/mL～200.0 μg/mL 内均具有良好的线性关系（r2＞0.999）；采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的信噪比（S/N）大于3倍确定检出限（LOD），S/N大于10倍确定定量限（LOQ），得到芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷组分的LOD为40 mg/kg和 50 mg/kg，LOQ 为 120 mg/kg和 150 mg/kg，结果见表1。

表1 保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1 Retention time,standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit

2.4 样品提取溶剂的选择

根据花青素的理化特性，易溶于水、乙醇、丙三醇、柠檬酸及盐酸等极性较强的溶剂，而难溶于苯、氯仿、乙醚、四氯化碳、乙酸乙酯等非极性的溶剂。同时花青素分子中含有多个酚羟基及吡喃环上有四价氧离子，具有酸及碱的性质，能溶于稀酸及稀碱，且对酸和碱很敏感，且在酸性溶剂中较稳定，所以通常采用酸化提取液作为提取剂来提取花青素。

所以本试验分别比较了蒸馏水、0.5%柠檬酸、0.5%盐酸、0.5%盐酸乙醇、0.5%盐酸丙三醇等5种提取溶剂的提取效果，溶剂：样品按4∶1的比例（体积比）混合，结果以两种目标物的平均回收率为比较依据。溶剂对提取率的影响见图4。

结果发现，与样品以一定比例混合的蒸馏水、0.5%柠檬酸、0.5%盐酸以及0.5%盐酸丙三醇提取的提取液，杂质较多，无法与芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷分离，色谱图中目标峰峰形拖尾，影响目标物的分析；而0.5%盐酸乙醇与样品以4∶1（体积比）提取的样液，目标峰可与杂质完全分离，且峰形对称，可以作为樱桃子饮料中0.5%盐酸乙醇的提取溶液。

图4 溶剂对提取率的影响Fig.4 Effect of solvent on extraction rate

2.5 加标回收与相对偏差

在以上试验的优化条件下，利用以已知花青素含量的樱桃汁饮料为基质进行加标回收率试验，在分别添加0.2、0.4、0.6 g/kg等3个梯度浓度的标准溶液，每个浓度平行测定5次，测定结果见表2。

表2 方法的回收率及相对标准偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可见，芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的加标回收率为88.4%～92.6%，相对标准偏差（RSD）为1.5%～2.2%，表明本试验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。

2.6 实际样品的测定

应用本文所建立的方法，对樱桃汁饮料中的芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷进行测定，能从饮料中快速地检测出芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷。此方法选择性强、重现性高，能达到基线分离，樱桃汁饮料的色谱图见图5。

图5 樱桃汁饮料的色谱图Fig.5 The chromatograms of cherry juice drink

如图5所示，是一款樱桃汁饮料中测定花青素的色谱图，芍药素-3-葡萄糖苷（6.991 min）、锦葵定-3-葡萄糖苷（9.248 min）。

3 结论

建立一种高效液相色谱-PDA检测器检测樱桃汁饮料中芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的分析方法。结果表明，在流动相：乙腈-5%磷酸梯度洗脱的条件下，目标物能得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。在515 nm的检测波长下，样品经过0.5%盐酸乙醇与样品以4∶1（体积比）提取后，可实现对目标物的有效提取。样品中的芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷的加标回收率能达到88.4%～92.6%，能满足检测目标物质的要求，可以准确快速有效地检测樱桃汁饮料中芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵定-3-葡萄糖苷两种花青素的含量。

[1]赵宇瑛,张汉.花青素的研究现状及发展趋势[J].安徽农业科学,2005,33(5)：904-905

[2]张长贵,董加宝,王祯旭.原花色素及其开发应用[J].四川食品与发酵,2006(4)：8-12

[3]韩泽梅,李晓波,张玉平,等.树莓种子原花青素的提取分离工艺研究[J].天然产物研究与开发,2006,18(9)：108-111

[4]伟光.张黎明.山楂叶原花青素提取分离工艺研究[J].食品工业研究,2008,29(3)：216-218

[5]马玉美.葡萄籽中原花青素提取分离纯化研究进展[J].湖南工程学院学报,2006,16(3)：88-90

[6]张磊,侯红萍.葡萄籽中原花青素的保健功能[J].山西食品工业,2005,32(4)：31-34

[7]耿敬章,秦公伟,张志健.超声波辅助提取樱桃中原花青素[J].中国食品添加剂,2010,12(7)：183-187

[8]刘艳秋,孟庆繁,高文韬.酸樱桃果实中原花青素提取工艺的研究[J].湖北农业科学,2014,53(6)：1384-1387

[9]杨博,鄢又玉,钟方旭,等.火棘果中原花青素提取工艺优化[J].中国食物与营养,2011,17(5)：60-66

[10]宋阳成,陈玉娟,李皓,等.蓝莓类饮料中花青素的快速检测方法[J].食品科学,2010,31(24)：334-336

[11]姚开,何强,吕远平,等.葡萄籽提取物中原花青素含量的测定[J].食品与发酵工业,2002,28(3)：17-19

[12]姚开,何强,吕远平,等.葡萄籽提取物中原花青素含量不同测定方法比较[J].化学研究与应用,2002,14(2)：230-232

[13]杨磊,苏文强,汪振洋,等.落叶松树皮提取物中低聚原花青素含量测定方法的研究[J].林产化学与工业,2004(24)：111-114

[14]鲍俊竹,陈月坤,徐桂花.测定葡萄籽提取物中原花青素含量的方法[J].农业科学研究,2005,26(1)：43-45

[15]肖付才,李华,王华.葡萄籽原花青素的提取和检测方法[J].食品研究与开发,2007,28(6)：165-168

Rapid Determination of Anthocyanins in Cherry Juice Drink by HPLC

AN Chun-zhi，WANG You-zhi
（NanHua College of Industry and Commerce，Guangzhou 510507，Guangdong，China）

A rapid and effective method was established for the determination of peonidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside in cherry juice drink by HPLC.After the sample was extracted by 0.5%ethanol hydrochloride，the targeted compound was separated on C18column（4.6 mm×150 mm，5 μm）using acetonitrile-5%phosphoric acid as mobile phase by gradient elution，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of peonidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside was in the range of 20.0 μg/mL-200.0 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999.The peonidin-3-glucoside detection limit was 40 mg/kg and the quantitative limit was 120 mg/kg.The malvidin-3-glucoside detection limit was 50 mg/kg and the quantitative limit was 150 mg/kg.The two targets recovery rate was 88.4%-92.6%.The method had the advantages of simple pretreatment，good extract effect and fast detection rate，and was suitable for the separation and quantitative detection of peonidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside in cherry juice drink.

cherry juice；anthocyanins；high performance liquid chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.035

2017-01-10

安春志（1978—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：中药、营养健康、药品经营管理。