环保透明脱蜡液Van-Clear与传统试剂在组织处理后HE染色及FISH法检测乳腺癌HER2基因中的比较*

陈志强， 王 莹△， 叶才果， 米贤军， 陈 昂， 钟守军，黄华勇， 徐秀梅， 代新珍， 邓文同， 刘超凡

1南方医科大学附属中山博爱医院病理科，中山 528400 2广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室，东莞 523808

环保透明脱蜡液Van-Clear与传统试剂在组织处理后HE染色及FISH法检测乳腺癌HER2基因中的比较*

陈志强1， 王 莹1△， 叶才果2， 米贤军1， 陈 昂1， 钟守军1，黄华勇1， 徐秀梅1， 代新珍1， 邓文同1， 刘超凡1

1南方医科大学附属中山博爱医院病理科，中山 5284002广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室，东莞 523808

目的 比较环保透明脱蜡液Van-Clear和二甲苯透明脱蜡制作的组织切片苏木精-伊红(HE)染色优良率，对比荧光原位杂交(FISH)法检测2种透明脱蜡液制作的乳腺癌组织切片的人类表皮生长因子受体2(HER2)基因扩增阳性率，探讨Van-Clear替代二甲苯的可行性。方法 收集中山市博爱医院2013年2月～2015年12月门诊及住院部送检的乳腺浸润性导管癌标本89例、乳腺增生标本125例、子宫平滑肌瘤标本193例、子宫平滑肌肉瘤标本12例、肺癌穿刺标本16例、绒毛标本139例，同一病变部位切取2个样本，用抽签法随机分为2组，命名为A、B组。A组采用二甲苯透明脱蜡制作切片574张；B采用Van-Clear透明脱蜡制作切片574张。依据切片染色情况判定切片等级，采用SPSS 20.0软件比较A、B组切片HE染色优良率；A、B组中乳腺浸润性导管癌标本再各制作切片89张，采用SPSS 20.0软件比较FISH法检测的HER2基因扩增的差异。结果 ①生物显微镜下，A、B两组切片HE染色结果细胞轮廓清晰、透明度好，细胞核与细胞质蓝红相映、色彩鲜艳，核质对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见、分辨良好，分裂象染色体呈现黑蓝色，各种成分层次分明。②A、B两组切片HE染色优良片分别为570张、572张，中等、差片4张、2张。染色优良率分别为99.30%、99.65%，两组间染色优良率差异无统计学意义(χ2=0.50，P>0.05)。③荧光显微镜下，A、B两组切片乳腺浸润性导管癌HER2双探针FISH检测结果组织轮廓和背景均清晰，探针定位准确，可见耀眼的红/绿荧光信号。④A、B两组切片检测乳腺浸润性导管癌HER2基因，FISH阳性率分别为24.72%、26.97%，两组间阳性率差异无统计学意义(χ2=0.50，P>0.05)，且FISH结果符合率为97.75%。结论 环保透明脱蜡液Van-Clear有替代传统试剂二甲苯应用于组织切片HE染色及FISH法检测乳腺癌HER2基因的潜在可能。

环保透明脱蜡液Van-Clear； 二甲苯； 组织切片； 苏木精-伊红染色； 乳腺浸润性导管癌； HER2基因； 荧光原位杂交

病理诊断至今仍然是临床诊断中最重要的诊断。2015年国家卫生和计划生育委员会医政医管局颁布了病理学科的第一批质控指标，包含了苏木精-伊红(HE)切片的优良率的过程性指标[1]。只有一张好的HE切片，才能期许后续的免疫组织化学和分子检测的准确性，进而保证病理诊断的准确性。众所周知，在HE切片制作及相关病理样本检测中，二甲苯是传统的透明脱蜡液。二甲苯的透明脱蜡作用贯穿于组织处理、后续的HE染色及分子病理检测整个过程。有研究[2]表明二甲苯具有潜在致癌性，国内外学者一直试图在寻找其安全的替代品。Neghab等[3]研究表明把环保矿物油作为透明脱蜡液用于HE染色，实验取得了与传统试剂二甲苯类似的良好染色效果。张进华等[4]应用GS环保试剂制作的石蜡切片提取DNA，进行实时荧光定量PCR技术扩增，结果证实GS液与常规试剂一样均能较好地保存组织中的DNA。

本研究所用Van-Clear是一种从桔皮或其他植物中提取的、不含芳香族化合物、性质稳定、对人体无危害的生物透明脱蜡液。研究旨在通过比较Van-Clear与二甲苯制作的组织切片HE染色优良率，比较荧光原位杂交(FISH)法检测两者制作的乳腺癌组织切片的人类表皮生长因子受体2(HER2)基因扩增阳性率，探讨Van-Clear环保透明脱蜡液替代传统透明脱蜡液二甲苯的可行性，为HE染色、FISH法检测乳腺癌HER2基因找到环保试剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂及仪器 Van-Clear环保透明脱蜡剂购自华烁科技股份有限公司葛店分公司。生产企业许可证号：鄂食药监械生产登20130115号(更)，注册证号：鄂(鄂州)食药监械(准)字2013第1400006号(更)。苏木精染液(哈瑞氏)、伊红染液(醇溶性)由中国上海宏兹实业有限公司生产。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自动密闭式组织脱水机、DRS-2000J-D2全自动染色机均为日本樱花检验仪器株式会社生产。Thermo HM325轮转石蜡切片机为德国Thermo公司生产，切片厚度4～5 μm。DM3000生物显微镜由德国徕卡公司生产。尼康ECLIPSE 80i荧光显微镜日本奥林巴斯株式会社生产。HER2探针由中国北京金菩嘉医疗科技有限公司提供，为GLP HER2/CSP17探针。S500-24荧光原位杂交仪为美国Thermobrit公司生产。

1.1.2 标本来源 选取中山市博爱医院2013年2月～2015年12月门诊及住院部送检的各种组织标本574例。其中大标本：乳腺浸润性导管癌标本89例、乳腺增生标本125例、子宫平滑肌瘤标本193例、子宫平滑肌肉瘤标本12例、绒毛标本139例，同一病变部位各取材2块，组织按照标准取材大小(1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm)切取。小标本：肺癌穿刺标本16例，同一病变部位各取材2块，按照长1.0 cm，直径0.1 cm大小切取。89例乳腺癌患者均为女性，年龄36.3～78.2岁，平均(51.9±2.8)岁。术前未行任何辅助治疗(内分泌治疗、放疗、化疗)，病理诊断均为乳腺浸润性导管癌，各标本均见明显的肿瘤。每例标本的2块组织用抽签法随机分为2组，命名为A、B组。A组采用二甲苯透明脱蜡制作切片；B采用Van-Clear透明脱蜡制作切片。

1.2 实验方法

组织处理：组织固定、取材后在全自动组织脱水机中进行固定、脱水、透明、浸蜡等处理。组织取材前后的固定均用4%中性缓冲甲醛，梯度乙醇脱水、根据A、B组的不同分别用二甲苯和Van-Clear透明、石蜡浸蜡，相关病理组织处理流程和时间按中华医学会病理学会病理技术相关规程在全自动组织脱水机中进行[5]，常规石蜡包埋，4～5 μm厚切片，裱片于防脱片载玻片上。

1.2.1 传统HE染色 A、B两组切片烤片后分别用二甲苯和Van-Clear脱蜡至水，梯度乙醇洗涤，流水洗，苏木精染色，流水洗，盐酸乙醇分化，流水洗，氨水返蓝，流水洗，醇溶性伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯和Van-Clear分别透明，中性树胶封固。HE染色流程和时间按中华医学会病理学会病理技术相关规程在全自动染色机中进行[6]。

1.2.2 HE染色切片评价标准 染色理想的切片HE染色在显微镜下应是：细胞轮廓清晰、透明度好，细胞核与细胞质应蓝红相映、色彩鲜艳，核质对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见、分辨良好，同一切片中红细胞、肌纤维、胶原纤维的伊红着色层次能区分[7]。对常规病理切片HE染色结果的评定依据国内外相关文献[8-9]推荐的质控评分标准：①优质，细胞轮廓清晰、细胞核与细胞质染色对比清晰、分辨良好、透明度好、同一切片中各种成分层次分明；②优良，切片中所有组织染色、透明度较好，但有些背景；③中等，切片中所有组织染色、透明度差普遍较弱，或出现大量背景；④差，测试片中所有组织染色、透明度差非常弱，或根本不染色。

1.2.3 乳腺癌HER2基因相关操作及结果判读 玻片预处理后放入65℃恒温箱烤片过夜，Van-Clear或二甲苯脱蜡后，依次室温置于100%、85%、70%的乙醇各2 min、50℃下用30%(W/V)酸性亚硫酸钠处理组织切片20～30 min。室温下氯化钠柠檬酸钠缓冲液(SSC)漂洗，胃蛋白酶K消化，于2×SSC溶液中漂洗，室温下将组织切片玻片依次置于梯度乙醇脱水，加热玻片至56 ℃。玻片和探针混合液，在70%(V/V)的甲酰胺/2×SSC变性液中，72℃～74℃下变性5 min，-20℃预冷的70%、85%和100%乙醇梯度脱水各3 min，玻片自然干燥，置于45～50 ℃烤片机上预热2～5 min后与探针杂交。将变性后的探针混合液10 μL滴于玻片杂交区域，将玻片置于预热的湿盒中，42 ℃保温箱中过夜杂交。将玻片置于3瓶50%(V/V)甲酰胺溶液中各漂洗10 min，将玻片置于2×SSC溶液中，漂洗10 min，将玻片置于0.1%(V/V)NP-40/2×SSC溶液中，漂洗5 min，将玻片室温浸泡在70%乙醇中，漂洗3 min。干燥后滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)封固，于荧光显微镜下观察。

1.2.4 FISH结果判读 判读标准参考相关文献[10-11]，我们重点关注环保试剂使用后是否影响细胞核的完整性、信号强度以及背景信号杂点的干扰等技术问题。

1.3 统计学处理

HE染色切片优良率、FISH结果阳性率的差异比较均用配对χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。HE染色优良率是指HE染色优良和优质切片数占同期HE染色切片总数的比例[12]。FISH结果阳性率是指FISH结果阳性占同期FISH结果总数的比例。FISH结果的符合率定义为以A组实验诊断结果为参照，B组实验诊断结果与其符合的情况。

2 结果

2.1 组织切片HE染色生物显微镜下的观察

A、B两组切片细胞轮廓清晰、透明度好，细胞核与细胞质蓝红相映、色彩鲜艳，核质对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见、分辨良好，分裂象染色体呈现黑蓝色，各种成分层次分明(图1)。

A：A组细支气管肺泡癌，非黏液性，肿瘤细胞沿尚存的肺泡壁生长(×100)；B：B组细支气管肺泡癌，非黏液性，肿瘤细胞沿尚存的肺泡壁生长(×100)；C：A组子宫平滑肌肉瘤，肿瘤细胞显示细胞核的多形性，并且容易找到核分裂象(×400)；D：B组子宫平滑肌肉瘤，肿瘤细胞显示细胞核的多形性，并且容易找到核分裂象(×400)图1 两组组织切片HE染色效果比较Fig.1 Results of HE staining in group A and B

2.2 组织切片HE染色优良率

A、B两组切片HE染色优质、优良片和中等、差片及染色优良率结果见表1。可见，两组间染色优良率差异无统计学意义(P>0.05)，说明环保试剂并不差于传统试剂。

2.3 FISH法检测乳腺癌HER2基因荧光显微镜观察

荧光显微镜下，A、B两组切片组织轮廓和背景均清晰，探针定位准确，可见耀眼的红/绿荧光信号(图2)。绿色为CSP17信号数，红色为HER2信号数，蓝色为细胞核。

表1 A、B组切片HE染色优良率Table 1 Comparison of HE staining quality between group A and group B

A：A组浸润性乳腺癌HER2基因FISH阴性，HER2/CSP17比值<2.0且平均HER2拷贝数/细胞<4.0；B：B组浸润性乳腺癌HER2基因FISH阴性，HER2/CSP17比值<2.0且平均HER2拷贝数/细胞<4.0；C：A组浸润性乳腺癌HER2基因FISH阳性，HER2/CSP17比值≥2.0；D：B组浸润性乳腺癌HER2基因FISH阳性，HER2/CSP17比值≥2.0图2 浸润性乳腺癌HER2基因DNA双色FISH图像(×1 000)Fig.2 Bicolor FISH images of HER2 genes of invasive breast cancer tissues(×1 000)

2.4 FISH法检测乳腺癌HER2基因阳性率

A、B两组乳腺癌组织切片HER2基因阳性率检测结果见表2，可见两组间HER2基因阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，且FISH检测结果符合率高达97.75%，说明环保试剂与传统试剂一致性好。

表2 A、B组乳腺癌组织切片HER2基因阳性率Table 2 Positive rate of HER2 genes in breast cancer tissue sections of group A and B

3 讨论

随着人类基因组研究的进展，人们对疾病的病理诊断也从依靠高质量HE切片的形态学深入到其发生发展的分子水平。前者是进行肿瘤组织形态学评价最原始的依据、临床病理诊断的基础；后者是分子特征的揭示，不仅有助于提高诊断的准确率，更有助于肿瘤医师及时有效地采取相应的临床措施[13]。

为了使石蜡能够浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，通过这种溶剂的媒介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。HE染色过程中当组织中的水分全部被该溶剂取代时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。这一过程称为透明，该溶剂称为透明剂[14]。众所周知，无论是经典的切片HE染色还是新兴的分子病理技术FISH，脱蜡都是必不可少的环节。石蜡切片的HE染色必须先用一种溶剂脱去切片中的石蜡，以使染料易于进入细胞和组织，这一过程称为脱蜡，该溶剂称为脱蜡剂[14]。FISH技术也需要脱去切片中的石蜡以使探针易于进入细胞和组织。

在石蜡包埋的样品中，二甲苯传统上被大量用于组织处理和染色，但有研究显示长期暴露于二甲苯，会对呼吸系统、中枢神经系统、心血管系统、肾脏系统造成健康危害[15-19]，因此寻找一个更安全的替代品以摆脱二甲苯毒性对病理学从业人员的健康威胁已变得迫在眉睫。本实验研究正是为解决此问题的。

透明脱蜡的作用机制是“相似相溶规律”：结构相似、分子间作用力的类型和极性相近的两种物质彼此更易互溶。二甲苯为无色透明有特殊气味的液体，是由间二甲苯、对二甲苯和邻二甲苯组成的芳香烃。石蜡是固态高级烷烃的混合物，主要为直链烷烃，还有少量带个别支链的烷烃和带长侧链的单环环烷烃。Van-Clear是从桔皮或其他植物中提取，分子式为CnH2n+2(n为8～12)，分子量为114～170的饱和直链烷烃混合物，是一种无色无味无毒的液体。与二甲苯的苯环的“弯”相比，Van-Clear的直链烷烃更“直”，与同是直链烷烃的石蜡结构更为相似，所以分子间结合得更紧，溶解度更大。

从图1可见2种透明脱蜡液在A、B组切片HE染色放大100～400倍生物显微镜下的效果：两组切片细胞轮廓清晰、透明度好，细胞核与细胞质蓝红相映、色彩鲜艳，核质对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见、分辨良好，分裂象染色体呈现黑蓝色，各种成分层次分明。这一现象与文献报道环保透明脱蜡液制作的石蜡切片在常规病理组织制片及染色中无差异相符[20-21]。鹿伟等[20]研究的是环保组织固定脱水系列套装试剂在标本处理中的使用，未涉及后续HE染色中的应用。郭宝强等[21]研究的是环保型GS套装染液试剂与传统含有二甲苯的HE染液进行染色对比，未涉及前面的标本处理的使用。而本研究所用的环保透明脱蜡液从标本的处理到组织染色过程均涉及使用，保证了整个实验过程的环保性、试剂使用的简便性。实验样本量更大，还对2种试剂制作切片HE染色的优良率差异做了统计学分析，从多角度保证了研究的严谨性与可信度。本研究涉及送检病理科的各种标本，常见标本如子宫平滑肌瘤、少见组织如子宫平滑肌肉瘤；大标本如乳腺浸润性导管癌、小标本如肺癌穿刺；质地致密、韧性大的标本如子宫平滑肌瘤，质地疏松、韧性小的标本如绒毛；良性增生非肿瘤组织如乳腺增生、恶性增生肿瘤组织如乳腺浸润性导管癌这种对组织处理、HE染色质量要求高的组织，从表1可知两组切片间HE染色优良率差异无统计学意义且两组切片HE染色优良率在99.30%～99.65%，符合三甲医院常规石蜡包埋-HE染色切片的优良率>98%的要求[9]。

从图2可见2种透明脱蜡液在FISH法检测A、B组乳腺癌切片的HER2基因放大1 000倍荧光显微镜下效果：两组切片组织轮廓和背景均清晰，细胞核完整，探针定位准确，可见耀眼的红/绿荧光信号，无背景信号杂点的干扰。此现象与时姗姗等[22]报道环保型透明脱蜡液与传统二甲苯处理的组织切片在FISH分子病理检测中的效果并无明显差异相一致。时姗姗等[22]研究的是5例乳腺癌HER2基因及5例肺癌EGFR基因，而本研究针对样本量更大的乳腺癌HER2基因进行了FISH阳性率的统计学分析。从表2可知两组切片间FISH检测结果符合率高、FISH阳性率差异无统计学意义，两组乳腺癌切片HER2基因FISH阳性率为24.72%、26.97%。与Rosa等[23]研究证实人HER2在20%～30%的原发性浸润性乳腺癌中有基因扩增和蛋白的过表达相符。与刘秋雨等[24]报道的44例乳腺癌荧光原位杂交检测HER2基因，阳性10例，阳性率为23%，基本上一致。

本研究以乳腺癌等各种病理科标本为对象，通过对比实验，提示环保透明脱蜡液Van-Clear的透明脱蜡效果满意，既可用于组织制片后HE染色，也可用于HER2基因检测时FISH组织切片的透明脱蜡，可望替代传统的透明脱蜡液二甲苯。作者推测根据相似相溶规律，Van-Clear的直链烷烃与石蜡组织极为相似，因此，其与石蜡的分子间结合得更紧密，更易互溶，为HE染液进入细胞和组织、FISH法检测乳腺癌人HER2基因中双探针进入细胞和组织提供了更为有利的条件，因此实验研究效果并不差于传统试剂二甲苯。

综上所述，应用环保透明脱蜡液Van-Clear减少了传统试剂二甲苯对环境与人体的危害，改用新型环保透明脱蜡液具有环保价值与临床工作的实际意义。然而迄今为止，因在质量控制、标准化、成本价格、毒力试验等方面原因，目前国内仍处于研究实验状态，未全面应用于日常病理检测工作中。本研究HE染色组织形态虽好，但并未囊括病理科所有种类标本的透明脱蜡染色，作为一种新型环保试剂问世时间短，远期效果还有待多种组织大样本量的验证。本研究FISH检测乳腺癌HER2基因效果虽佳，与传统试剂相比较阳性率差异无统计学意义，但到底以哪个阳性率为准会对后期指导个体化治疗产生不同的后果。如果结合检测同一标本使用2种透明脱蜡液的HER2的免疫组化染色，以初步确定不同的阳性率是Van-Clear透明脱蜡产生的假阳性，还是二甲苯产生的假阴性又或者通过多次重复性实验排除手工操作存在差异的可能，以还原实验的真实结果，相信疑惑将会迎刃而解。另外，Van-Clear作为环保产品在免疫组织化学染色(IHC)、突变分析等分子检测的使用效果有待在大样本、多病种中去摸索研究才能广泛应用于临床病理研究中。

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(2016-06-13 收稿)

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Comparison of Tissue Dewaxing by Environment-friendly Transparent Dewaxing Solution Van-Clear and Conventional Reagents for HE Staining and Detection of HER2 Genes by FISH in Breast Cancer Tissues

Chen Zhiqiang1，Wang Ying1△，Ye Caiguo2etal

1Department of Pathology，Zhongshan Bo’ai Hospital Affiliated to Southern Medical University，Zhongshan 528400，China2Key Laboratory of Medical Molecular Diagnosis，Guangdong Province Affiliated to Guangdong Medical University，Dongguan 523808，China

Objective To compare HE staining after tissue dewaxing by environment-friendly transparent dewaxing solution Van-Clear and conventional reagents，and compare positive rate of human epidermal growth factor receptor-2(HER2)gene amplification byinsituhybridization(FISH)assay in breast cancer tissue sections after the two dewaxing methods，and further explore the feasibility of Van-Clear replacing xylene.Methods Totally，89 cases of infiltrating ductal breast carcinoma，125 cases of hyperplasia of mammary glands，193 cases of leiomyoma of uterus，12 cases of leiomyosarcoma of uterus，16 cases of lung cancer，and 139 cases of villus specimens submitted by the outpatient and inpatient departments in Zhongshan Bo’ai Hosipital were all collected from February 2013 to December 2015.Two samples were taken from the same lesion site，and randomly assigned to group A and B.Group A used xylene dewaxing to make 574 slices，while group B used Van-Clear transparent dewaxing to make 574 slices.The slices were graded according to staining levels.Good HE staining rate was compared between group A and B by using SPSS 20.0.Eighty-nine sections from breast infiltrating ductal carcinoma tissues in group A and B were prepared.Difference in HER2 gene amplification detected by FISH was compared between the two groups.Results ①Under the biological microscope，the HE staining results of the sections in group A and B were as follows：The cells had clear outline and good transparency.Their nucleus and cytoplasm had bright colors such as blue and red.The nucleoplasm had obvious contrast.The nuclear membrane and nuclear staining granules were clearly visible and well resolved.The mitotic chromosome was dark blue with distinct components and gradations.②In group A and B，the number of the HE staining slides of different quality was as follows，high quality：468 and 476，fine quality：102 and 96，medium quality：4 and 2，bad quality，0 and 0，respectively.The good staining rate was 99.30% and 99.65% in group A and B，respectively(χ2=0.50，P>0.05).③Under the fluorescence microscope，the detection results of HER2 genes in infiltrating ductal breast carcinoma specimens by using dual probe FISH technique were as follows：The tissue profile and the background were both clear；the probe was accurate；and the red/green fluorescence signals were visible.④ HER2 genes in the infiltrating ductal breast carcinoma specimens were detected，and the positive rate of FISH was 24.72% and 26.97%，respectively(χ2=0.50，P>0.05).Besides，the coincidence rate of FISH result was 97.75%.Conclusion The environment-friendly transparent dewaxing solution Van-Clear has the potential to replace the conventional reagent xylene in the application of the HE staining and the use of FISH technique to detect HER2 genes in the breast cancer after both tissue processed.

environment-friendly transparent dewaxing solution Van-Clear； xylene； tissue section； hematoxylin eosin staining； infiltrating ductal breast carcinoma； HER2 gene； fluorescenceinsituhybridization

*国家自然科学基金资助项目(No.81572782)；广东省医学科研基金立项课题(No.A2017321)； 广东省中山市卫生和计划生育局医学科研立项课题(No.2014J128)

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.016

陈志强，男，1981年生，副主任技师，E-mail：765228687@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：334234558@qq.com