SIRT2对脓毒症小鼠远期抑郁的影响及其机制研究*

占大钱， 吕 青， 陈华文， 静 亮， 冯 俊， 祝 伟△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊内科，武汉 430030 2华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，武汉 430030

SIRT2对脓毒症小鼠远期抑郁的影响及其机制研究*

占大钱1， 吕 青2， 陈华文1， 静 亮1， 冯 俊1， 祝 伟1△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊内科，武汉 4300302华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，武汉 430030

目的 探讨沉默信息调节基因2(SIRT2)对脓毒症小鼠远期抑郁的影响及其机制。方法 腹腔注射内毒素(LPS)制备脓毒症小鼠模型，实验动物随机分成3组：对照组(Control)、脓毒症组(LPS)、干预组(AGK2+LPS)。通过悬尾实验、强迫游泳实验和糖水偏好实验来评估小鼠抑郁状况，Western blot法检测小鼠脑内海马组织SIRT2和乙酰化核因子-κB(NF-κB)蛋白表达，免疫荧光法检测小鼠脑内海马组织Iba1活性，ELISA法测定海马组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平。结果 脓毒症小鼠远期出现明显的抑郁相关表现，脑组织SIRT2蛋白表达水平降低，乙酰化NF-κB p65蛋白表达明显增加，小胶质细胞活化增加，脑组织内TNF-α和IL-1β水平增加(P<0.05，P<0.01)。SIRT2特异性抑制剂AGK2抑制脑组织内SIRT2的表达(P<0.01)，而且乙酰化NF-κB p65蛋白表达、小胶质细胞活化和脑组织内TNF-α和IL-1β水平均进一步增加(P<0.05，P<0.01)，远期抑郁相关表现也明显加重(P<0.01)。结论 在脓毒症小鼠中，SIRT2表达下降抑制NF-κB去乙酰化，进而加重大脑组织炎症反应和远期抑郁。

沉默信息调节基因2； 核因子-κB； 抑郁； 脓毒症

脓毒症是重症监护病房(ICU)患者死亡的主要原因，占10%到50%[1]。脓毒症相关性脑病(septic associated encephalopathy，SAE)是由脓毒症引起的中枢神经系统弥散性功能障碍，是ICU常见的临床综合征，发病率高达70%，主要表现为精神状态和认知功能的改变。脓毒症患者一旦合并SAE，其病死率将显著增加，可高达49%[2-3]。

SAE可引起急性和慢性认识和情感障碍。谵妄是最易发现的急性表现，脓毒症存活患者数年后仍有认识和情感障碍[4]。目前，SAE具体机制尚未完全清楚，临床上对其也缺乏有效的治疗措施。沉默信息调节基因2(silent information regulator 2，SIRT2)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的组蛋白脱乙酰酶，为Sirtuins家族成员之一，其在脑组织中含量丰富，在多种神经变性疾病及神经炎症反应中有重要作用[5-6]。研究发现：SIRT2与阿尔茨海默病患者抑郁发生密切相关[7]。本研究旨在进一步探讨SIRT2对脓毒症小鼠远期抑郁的影响及其机制。

1 材料和方法

1.1 动物和实验材料

60只雄性C57BL/6小鼠，体重20～25 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。所使用药物和试剂：内毒素(LPS，serotype 055：B5，Sigma，美国)；SIRT2特异性抑制剂AGK2(EMD Millipore，美国)；TNF-α ELISA试剂盒(CUSABIO，中国)；IL-1β ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)；Iba1抗体(1∶500；Wako Chemicals，美国)；SIRT2抗体(Sigma，美国)；乙酰化NF-κB p65抗体(Abcam，美国)。

1.2 动物模型和分组

60只小鼠随机分成3组：对照组(Control)、脓毒症组(LPS)、干预组(AGK2+LPS)，每组各20只。腹腔注射LPS制备脓毒症小鼠模型。对照组小鼠腹腔注射PBS(10 mL/kg)，脓毒症和干预组小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg)。干预组小鼠于腹腔注射LPS前2 h予腹腔注射AGK2(82 mg/kg)，脓毒症小鼠予腹腔注射二甲基亚砜(DMSO)作为对照。各组取10只小鼠于脓毒症模型建立后第3天处死，留取脑组织标本供相关指标检测，各组10只小鼠于脓毒症模型建立后第28和29天进行行为学检测[8]。

1.3 行为学观察

按照既往研究的实验步骤，进行悬尾实验、强迫游泳实验和糖水偏好实验。行为学观察严格按照相关实验要求进行[8]。

1.4 Western blot法检测脑组织内SIRT2和乙酰化NF-κB水平

取-20℃保存的海马组织200 mg，于研钵中充分研磨(冰上操作)。

检测海马组织内SIRT2和乙酰化NF-κB：加样、电泳、转膜；将滤膜与5%脱脂奶粉放入塑料袋中，封口，37℃孵育1 h，封闭滤膜，洗膜，分别加入单克隆抗体(1∶400)，4℃过夜，洗膜5 min，换塑料袋加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，37℃水平摇床孵育1 h，洗膜，化学发光底物孵育[2]，硝酸纤维素滤膜暗室感光，胶片感光，冲洗胶片。利用凝胶成像分析仪将胶片图像扫描进计算机，用Bio-Red Quantity One 41.0软件系统分析图像，读取数据，以积分灰度值表示。化学发光剂由NEN Life Science Products，USA公司提供，以β-actin作为内参照。

1.5 免疫荧光法检测小胶质细胞活化

将冰冻切片在室温下风干30 min，用4%的多聚甲醛固定10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，然后加入10%的BSA封闭30 min，加入一抗，4℃冰箱中放置过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，加入荧光抗体(Alex568，1∶200)，常温孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min，加入DAPI染液孵育5 min，PBS冲洗3次，每次5 min，防猝灭剂封片液封片，在荧光显微镜下观察并获取图像。

1.6 ELISA法检测海马组织TNF-α和IL-1β水平

取海马组织，使用ELISA试剂盒检测海马组织TNF-α和IL-1β水平，严格按说明书操作。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 行为学观察

在脓毒症组，悬尾实验和强迫游泳实验的结果均表现为小鼠不动时间明显增加，糖水偏好实验的结果表现为小鼠对糖水的偏好降低；在使用了AGK2后，上述表现更为严重(P<0.05，P<0.01)。见图1。

A：悬尾实验；B：强迫游泳实验；C：糖水偏好实验；①对照组；②脓毒症组；③干预组；与对照组比较，*P<0.05 **P<0.01；与脓毒症组比较，#P<0.05 ##P<0.01图1 SIRT2对脓毒症小鼠远期情绪的影响Fig.1 Effect of SIRT2 on long-term depression in mice with sepsis

2.2 SIRT2和乙酰化NF-κB水平的变化

在脓毒症组，脑组织内SIRT2表达水平降低(P<0.05)，AGK2干预可以使脑组织内SIRT2表达水平进一步降低(P<0.01)。乙酰化NF-κB的表达水平则相反，LPS使乙酰化NF-κB p65的表达水平增加，AGK2干预将促使其表达水平进一步增加(均P<0.01)。见图2。

2.3 小胶质细胞活化

LPS使脑组织内Iba1的表达水平明显增加，提示小胶质细胞活化。AGK2干预促使脑组织内Iba1表达水平进一步增加，小胶质细胞活化进一步加剧(P<0.05，P<0.01)。见图3。

①对照组；②脓毒症组；③干预组；与对照组比较，*P<0.05 **P<0.01；与脓毒症组比较，##P<0.01图2 小鼠海马组织内SIRT2及乙酰化NF-κB蛋白表达水平Fig.2 Expression of SIRT2 and acetylated NF-κB protein in hippocampus tissue in mice with sepsis

①对照组；②脓毒症组；③干预组(右上角，×400)；与对照组比较，**P<0.01；与脓毒症组比较，#P<0.05 图3 免疫荧光检测小鼠海马组织内Iba1的表达(×200)Fig.3 Detection of expression of Iba1 in hippocampus tissue of mice with sepsis by immunofluorescence assay(×200)

2.4 TNF-α和IL-1β水平变化

LPS使脑组织内TNF-α和IL-1β水平增加，AGK2干预促使其水平进一步增加(P<0.05，P<0.01)。见图4。

①对照组；②脓毒症组；③干预组；与对照组比较，*P<0.05 **P<0.01；与脓毒症组比较，#P<0.05 ##P<0.01图4 小鼠海马组织中TNF-α 及IL-1β的表达水平Fig.4 Expression of TNF-α and IL-1β in hippocampus tissue in mice with sepsis

3 讨论

脓毒症是极具破坏性的全身炎症反应综合征，可导致多器官功能不全如肾脏、肺脏及肝脏等。大脑也是脓毒症受累的重要器官，表现为SAE。SAE定义是伴随脓毒症出现的弥漫性脑功能障碍，并排除直接颅内感染、外伤以及其他脑病如肝性脑病、肾性脑病等。合并SAE的脓毒症患者死亡率显著增加，因此，早期诊断及干预对降低相关的患病率及死亡率有重要的临床意义。但是，由于SAE缺乏特异性的临床和生物学标志，其临床诊断较为困难[4]。

大量动物及临床研究证据表明，脓毒症存活患者数年后仍有认知、记忆以及情感障碍如抑郁或焦虑表现，并认为海马组织神经元的缺失是记忆缺陷的原因[4]。在本研究中，我们发现：LPS腹腔注射诱导小鼠脓毒症后，小鼠出现明显的远期抑郁表现。进一步研究发现，LPS诱导的脓毒症小鼠海马组织中小胶质细胞激活，炎症细胞因子TNF-α和IL-1β水平明显增加。Anderson等[9]研究也表明，LPS诱导的脓毒症存活小鼠1月后仍表现抑郁和焦虑行为，但并无认知障碍；脓毒症小鼠脑组织内小胶质细胞持续活化，而NF-κB抑制剂可逆转上述表现。目前研究表明，小胶质细胞激活及神经炎症反应在SAE的发病中具有重要作用。在SAE中，小胶质细胞及星状细胞激活，释放炎症介质引起神经细胞变性和脑功能障碍[2]。目前，SAE被认为是多因素导致的，如脑灌注与微循环障碍、血脑屏障障碍、炎症反应和氧化应激以及神经递质传递异常等，而炎症反应至关重要[2]。我们的前期研究也发现神经炎症促进了脓毒症后的抑郁发生[8]，但具体的机制并未阐明。

SIRT2是依赖于NAD的组蛋白脱乙酰酶家族成员之一，其在海马组织含量丰富，参与调控神经炎症反应。研究表明，抑制SIRT2表达对神经变性疾病如帕金森病起保护作用，其机制可能是通过抑制小胶质细胞激活和炎症反应[10-11]；相反，其他研究表明，抑制SIRT2促进神经炎症反应[12-13]。我们研究发现，与对照组相比，脓毒症小鼠脑组织内SIRT2表达水平降低，而小胶质细胞激活及炎症因子TNF-α和IL-1β水平增加；使用SIRT2的特异性抑制剂AGK2后，小胶质细胞活化进一步增强，炎症细胞因子TNF-α和IL-1β水平进一步增加，小鼠的远期抑郁表现也进一步加重。Pais等[12]研究发现：LPS刺激脑组织后可以导致脑组织内SIRT2水平降低，而SIRT2可以抑制LPS所致的小胶质细胞活化，减轻神经炎症反应。但是，SIRT2抑制小胶质细胞活化，减轻神经炎症反应的作用机制尚不清楚。我们研究还发现，脓毒症组SIRT2水平下降，而乙酰化NF-κB p65表达增加；加入AGK2干预后，SIRT2表达进一步降低，而乙酰化NF-κB p65表达显著增加。据此推测，抑制SIRT2可促进NF-κB p65乙酰化和激活，从而导致NF-κB下游基因如促炎症因子等表达增强。其他研究也表明，抑制SIRT2促进小胶质细胞激活和NF-κB乙酰化，上调NF-κB靶基因表达[13]。NF-κB是一种重要的核转录因子，参与脓毒症的病理生理进程[14]。细菌的内毒素通过一定途径使细胞质NF-κB活化并迅速发生核移位，在细胞核中寻找特定靶基因启动子区的κB位点并与之结合，编码下游各种细胞因子的合成和释放[15]。由此，我们认为：SIRT2可以通过去乙酰化NF-κB，减轻神经炎症反应，改善远期抑郁。

本研究阐述了SIRT2在脓毒症后远期抑郁发生中的作用及其机制，为脓毒症后远期抑郁发生的防治提供了新的治疗靶点和治疗思路。

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(2017-04-05 收稿)

Effect of SIRT2 on Long-term Depression in Mice with Sepsis and Related Mechanism

Zhan Daqian1，Lv Qing2，Chen Huawen1etal

1Department of Emergency Medicine，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China2Department of Pharmacology，School of Basic Medical Sciences，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the effect of SIRT2 on long-term depression in mice with sepsis and its mechanism.Methods The mice were randomly divided into three groups：control group，sepsis group(injected intraperitoneally with LPS)and intervention group(injected intraperitoneally with AGK2 and LPS).The depressive status of mice was assessed by the tail suspension test，forced swim test and sugar preference test.The expression levels of SIRT2 and acetylated NF-κB protein in hippocampus tissue were detected by Western blotting.The activity of Iba1 in hippocampus tissue was measured by immunofluorescence assay.The levels of TNF-α and IL-1β in hippocampus were measured by ELISA.Results Mice with sepsis showed significant depression-related symptom.The level of SIRT2 in hippocampus tissue was decreased，and the level of acetylated NF-κB p65，the activation of microglia，and the levels of TNF-α and IL-1β in hippocampus tissue were significantly increased(P<0.05，P<0.01).AGK2，selective inhibitor of SIRT2，inhibited the expression of SIRT2 in hippocampus tissue(P<0.01)，and the expression of acetylated NF-κB p65 protein，the activation of microglia and the levels of TNF-α and IL-1β in hippocampus tissue were further increased(P<0.05，P<0.01)，and long-term depression-related symptom was significantly aggravated(P<0.01).Conclusion Reduction of SIRT2 increased the neuroinflammation and depression in mice with sepsis through inhibiting NF-κB deacetylation.

SIRT2； NF-κB； depression； sepsis

*湖北省自然科学基金资助项目(No.2015CFB284)

R515.3

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.011

占大钱，男，1982年生，医学博士，主治医师,E-mail：zhandaqian117@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：zhuwei@tjh.tjmu.edu.cn