参贝消瘿颗粒的HPLC特征图谱

张磊，马海春，苏酩，刘善新，王杰，靳光乾*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；3.菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000；4.山东大学附属省立医院，山东 济南 250021)

【中药与天然活性产物】

参贝消瘿颗粒的HPLC特征图谱

张磊1,2，马海春3，苏酩2，刘善新2，王杰4，靳光乾2*

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；3.菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000；4.山东大学附属省立医院，山东 济南 250021)

建立了参贝消瘿颗粒的HPLC特征图谱。采用ODS-2 Hypersil C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，以乙腈为流动相A，以0.1% 磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长225 nm，进样量5 μL。建立的特征图谱具有良好的精密度、重复性和稳定性，9批样品特征图谱的相似度均大于0.95，确定了5个共有特征峰，并指认出其中2个为芍药苷、迷迭香酸，同时通过对单味药材的特征图谱的对比分析确定各特征峰的来源。该方法准确可靠，专属性强，可用于参贝消瘿颗粒的质量控制。

参贝消瘿颗粒；HPLC；特征图谱

桥本甲状腺炎(HT)是典型的器官特异性自身免疫性疾病[1]，属于中医的“瘿病”范畴[2-3]。其发病年龄主要集中在40～60岁，女性发病率高且近年来有明显上升趋势[4-5]。近年来中医药在本病的治疗和研究领域均取得了较好的成果[6]，但临床使用的中成药较少见。参贝消瘿颗粒的组方是山东大学附属省立医院长期临床经验总结而成，由白芍、夏枯草、乌药、黄芪等15味中药组成，具有理气舒郁、化痰清热、散结消瘿的功能，用于治疗桥本甲状腺炎气郁痰阻、壅结化热证，在临床中取得了较好的疗效。中药复方是依靠其所含的多种化学成分发挥综合的医疗作用，而中药特征图谱具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点，能较全面地反映中药复杂的化学成分及其相对比例，更加全面地展示中成药质量[7-8]。为制订参贝消瘿颗粒的质量标准，本文对参贝消瘿颗粒进行了HPLC特征图谱研究。

1 材料与试剂

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪，Ultimate 3000紫外检测器，Chromeleon7工作站(美国Thermo)；BP211D 电子天平(德国Sartorius)； LC-350A超声波中药处理器(济宁市中区鲁超仪器厂，功率250 W，频率40 kHz)。

1.2 药品和试剂

芍药苷(批号110736-201438，纯度：96.4%)、迷迭香酸(批号111871-201404，纯度：98.6%)对照品均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；参贝消瘿颗粒由本课题组提供；药材购自山东百味堂中药饮片有限公司、山东上药集团有限公司，经山东省中医药研究院靳光乾主任药师鉴定，均为《中国药典》2015版一部[9]各药材项下收载的正品；乙腈为色谱纯(美国Fisher Scientific)；超纯水(美国MiLLipore)；其余试剂均为分析纯。

2 特征图谱的测定方法与结果

2.1 色谱条件

ODS-2 Hypersil C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm，美国Thermo)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～60 min，2% ～ 30% A)；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长225 nm；进样量5 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

取参贝消瘿颗粒研细，取3 g，精密称定，加入甲醇25 mL，称重，超声处理30 min，放冷后称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷、迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含芍药苷120 μg、迷迭香酸10.4 μg的混合溶液，即得。

2.2.3 各药材溶液的制备

取处方中药材各10 g，参照参贝消瘿颗粒样品的制备工艺及2.2.1项下方法分别制成药材溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验

精密吸取同一供试品(批号20151204)溶液5 μL，按2.1项下色谱条件连续进样5次，以芍药苷为参照物，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各特征峰的相对保留时间相对标准偏差均小于0.2%(n=5)，相对峰面积相对标准偏差均小于3%(n=5)。

2.3.2 重复性实验

取同一批供试品(批号20151204)5份，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定5次，以芍药苷为参照物，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各特征峰的相对保留时间相对标准偏差均小于0.1%(n=5)，相对峰面积相对标准偏差均小于3%(n=5)。

2.3.3 稳定性实验

精密吸取同一供试品(批号20151204)溶液5 μL，分别在0、4、8、12、24 h进样测定，以芍药苷为参照物，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各特征峰的相对保留时间相对标准偏差均小于1%(n=5)，相对峰面积相对标准偏差均小于3%(n=5)。

2.4 特征图谱的建立

取9批参贝消瘿颗粒研细，各取3 g，精密称定，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。将混合对照品溶液进样，确定对照品的位置。采用中国药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)应用中位数法，对9批样品进行多点校正，时间窗为0.10，自动匹配，即得参贝消瘿颗粒HPLC特征图谱共有模式，见图1～3，以芍药苷为参照计算9批样品图谱的相似度，结果均大于0.95，见表1。经分析对比，确定5个共有峰作为其特征峰，以1号峰(芍药苷对照品相应的峰)为S峰，计算其余特征峰的相对保留时间及相对峰面积，结果见表2～3。

图1 9批样品特征图谱Fig.1 Specific chromatograms of 9 batches of samples

1芍药苷；2迷迭香酸。图2 对照品HPLC图Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances

1芍药苷；4迷迭香酸。图3 特征图谱共有模式Fig.3 Common mode of specific chromatograms

表1 9批样品相似度结果(n=9)

表2 9批样品相对保留时间(n=9)

表3 9批样品相对峰面积(n=9)

2.5 特征峰归属

通过与图2对照，确定图3中的1号峰为芍药苷，4号峰为迷迭香酸。通过与单味药材特征图谱比较，发现1、2号峰来源于白芍，3号峰来源于乌药，4号峰来源于夏枯草，5号峰来源于黄芪，见图4。

S1白芍；S2黄芪；S3乌药；S4夏枯草；S5对照图谱。图4 参贝消瘿颗粒与单味药材特征图谱比较Fig.4 Comparison of specific chromatograms between Shenbei Xiaoying granules and single medicinal herb

3 讨论

实验中首先对提取溶剂进行选择，分别用90%甲醇、95%甲醇、甲醇、无水乙醇作为提取溶剂，结果检测发现无水乙醇提取液峰较少，90%甲醇、95%甲醇提取液和甲醇提取液无明显差别，因此选择甲醇作为提取溶剂。对提取方法进行比较，分别用超声和加热回流方法进行提取，结果两种提取方法所测结果基本一致，因此选择超声作为提取方法。对检测波长进行了考察，分别选取210、220、225、230、240、260、280、330 nm波长进行检测，结果在225 nm波长下基线平稳且各色谱峰响应适中，故选择225 nm作为检测波长。对流动相进行考察，水相分别用纯水、0.1%冰乙酸溶液和0.1%磷酸溶液进行检测，结果在0.1%磷酸溶液作为流动相时，基线平稳且峰形较好，因此选择0.1%磷酸溶液作为水相流动相。

本研究建立了参贝消瘿颗粒的特征图谱，9批样品的相似度大于0.95，确定了5个共有特征峰，其相对保留时间相对标准偏差小于0.8%(n=9)，说明特征图谱的色谱行为基本相同，而相对峰面积相对标准偏差较大，是由于生产制剂使用的药材有差异所致。同一种药材，产地、批次、采收期、储存时间不同均可导致药材成分含量的差异。通过与对照品比较，指认出1号峰为芍药苷，4号峰为迷迭香酸，并通过与处方中药材的特征图谱单独比较，指认出5个共有峰中1、2号峰来源于白芍，3号峰来源于乌药，4号峰来源于夏枯草，5号峰来源于黄芪。本研究所建立的特征图谱灵敏度高、专属性强，结果准确，能够较为全面地反映参贝消瘿颗粒的内在质量并为其质量标准的建立提供参考。

[1]张明霞，李效忠，杲海霞，等.甲宁治疗桥本甲状腺炎机制的实验研究[J].中成药，2009，31(2)：290-292.

[2] 沈斐婕，龚凡，罗洁，等.中药对气阴两虚型桥本甲状腺炎患者甲状腺自身抗体水平影响的回顾性分析[J].中华中医药杂志，2015，30(4)：1212-1215.

[3] 范尧夫，刘克冕，张会峰，等.中西医结合治疗桥本甲状腺炎甲状腺功能减退的Meta分析[J]. 中国实验方剂学杂志，2016，22(3)：221-224.

[4] 高青，简立信，许金国.桥本甲状腺炎病因病机与临床治疗研究进展[J].中国中药杂志，2012，37(20)：3003-3006.

[5] 马跃，周仁义，韩萍. 桥本甲状腺炎治疗进展[J].中国实用内科杂志，2010，30(5)：459-461.

[6]石晓静，殷佩浩. 桥本甲状腺炎的治疗研究进展[J].世界中西医结合杂志，2014，9(10)：1142-1144.

[7]谢培山. 中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用[J].中国中药杂志，2001，26(10)：5-7.

[8]李强，杜思邈，张忠亮，等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药，2013，44(22)：3095-3104.

[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying Granules

ZHANG Lei1,2，MA Hai-chun3，SU Ming2， LIU Shan-xin2，WANG Jie4, JIN Guang-qian2*

(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China； 2.Shandong Academy of Chinese Medicine，Jinan 250014，China；3. Heze Food and Drug Inspection and Resarch Institute, Heze 274000，China；4. Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021，China)

∶The HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying Granules was established. Specific chromatogram was carried out on a ODS-2 Hypersil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), with gradient elution consisting of acetonitrile as mobile phase A and 0.1% phosphoric acid solution as mobile phase B. Column temperature was 30 ℃, flow rate was 1.0 mL·min-1，detection wavelength was 225 nm, and sample volume was 5 μL. The established HPLC specific chromatogram of Shenbei Xiaoying granules has good precision, repeatability and stability. The similarity of characteristic maps of 9 batches of Shenbei Xiaoying Granules was all greater than 0.95. Five common specific chromatogram peaks were determined, and two peaks were identified as paeoniflorin and rosemary acid．At the same time, the source of each characteristic peak in HPLC specific chromatogram was determined by comparing and analyzing the HPLC specific chromatogram of single medicinal herb. This method is accurate, reliable and specific, which can be used for the quality control of Shenbei Xiaoying Granules.

∶Shenbei Xiaoying Granules；HPLC；specific chromatograms

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.001

2016-11-10

山东省科技发展计划(2014GGH218026)；济南市科技计划(201219008)；济南市高校院所计划(201401255)

张磊(1992—)，男，硕士研究生，研究方向为中药新剂型及新技术。

*通信作者，靳光乾(1962—)，主任药师。Tel：0531-82949812,E-mail：jgqjn1962@sina.com

R284.1

A

1002-4026(2017)04-0001-05