利用非线性化学指纹图谱法检测奶粉中掺杂的尿素含量

马永杰，包洪亮，董文宾

（1.洛阳师范学院食品与药品学院，河南 洛阳 471000；2.陕西科技大学化学与化工学院，陕西 西安 710021；3.洛阳师范学院数学科学学院，河南 洛阳 471000）

利用非线性化学指纹图谱法检测奶粉中掺杂的尿素含量

马永杰1,2，包洪亮3，董文宾2

（1.洛阳师范学院食品与药品学院，河南 洛阳 471000；2.陕西科技大学化学与化工学院，陕西 西安 710021；3.洛阳师范学院数学科学学院，河南 洛阳 471000）

采用“硫酸-丙二酸-溴酸钠-溴化钠-硫酸铈铵”为振荡体系，利用非线性化学指纹图谱法测定奶粉中掺杂的尿素。先向奶粉中掺入不同量的尿素，配成掺杂尿素的奶粉标样，每份奶粉标样的总量为1.00 g。通过非线性化学指纹图谱法对奶粉标样进行测定，运用最小二乘法，拟合出诱导时间相对于奶粉中掺杂尿素含量之间的一元线性关系，可求出奶粉中掺杂的尿素含量。实验表明该方法可以达到以下指标：当奶粉中掺杂的尿素含量在0～40.00 mg/g范围内时，尿素含量与诱导时间线性关系良好，相关系数R2为0.996 6和0.999 5，回收率为95.48%～104.06%，相对标准偏差不大于1.82%，奶粉1#检出限为3.3×10-4mg/g，奶粉2#检出限为4.5×10-4mg/g，奶粉3#检出限为1.1×10-4mg/g。方法准确度高，操作简单，是一种切实可行的测定奶粉中掺杂尿素的方法，也可作为复杂样本中其他成分定量分析借鉴的方法。

非线性化学指纹图谱；奶粉；线性回归法；尿素含量测定

婴儿阶段是人生中最重要的生理阶段，此时期生长发育旺盛，需要摄入大量且易于消化吸收的营养全面的物质[1]。母乳无疑是婴儿最理想的天然食品。当母乳缺乏时，以牛乳或羊乳为基乳的婴幼儿配方奶粉就成为母乳的替代品，用来补充婴幼儿的营养需求[2]。最近几年，随着乳品工业的快速发展及消费者对乳品需求量的逐年上升，乳品中掺杂尿素、淀粉、蛋白粉、糊精及三聚氰胺等物质的现象越来越严重。

尿素又名脲，学名为碳酰胺，其水溶液呈中性，是有机氮肥中的一种。在乳及乳制品中掺杂尿素，可以增加乳中的氮含量，进而提高蛋白质检测含量和增加密度。尿素在乳制品行业中具有十分重要的地位，它可以在乳及乳制品中自然产生[3-4]，其含量范围为0.18～0.40 mg/g[5]。据文献[6-9]报道，尿素在乳及乳制品中的含量应低于0.70 mg/g[7]，如果乳中的尿素含量超过正常范围，能导致许多健康问题，如溃疡、癌症、消化不良、胃酸、肾功能疾病等。因此，尿素的检测和评价在乳品行业、食品加工技术及临床分析中都具有十分重要的意义。

目前，利用光谱和色谱建立的指纹图谱技术，因其具有整体性、关联性和模糊分析等特点，比较适合在食品或药品中应用[10]。其中常用的指纹图谱技术有高效液相色谱[11]、超高效液相色谱-串联质谱[10]、紫外、红外和近红外[12]等。如利用色谱法、紫外分光光度法及红外光谱分析法等检测乳及乳制品中的尿素[13]。这些方法多数存在样品前处理复杂，且要求熟练的技术人员才能完成等问题。为此，探索一种既简单、快速，又无需分离和提纯测定奶粉中掺杂尿素的方法十分必要。

B-Z（Belousov&Zhabotinsky）振荡反应的发现促使人们开始对非线性化学反应现象进行研究[14]。非线性化学指纹图谱是一种建立在非平衡化学理论基础之上的动力学指纹图谱，其反应包括化学振荡、化学湍流、化学斑图和化学波等许多化学混沌现象[14-15]。对于非线性化学的反应机理[15-16]和应用[17-19]，国内外学者已经进行了较为广泛而深入的研究，并报道了许多研究成果[20-23]。采用非线性化学指纹图谱法测定啤酒中乙醇含量已有报道[24]，但是利用非线性化学指纹图谱法对奶粉中掺杂尿素的检测鲜见报道。

因此，本研究基于“硫酸-丙二酸-溴酸钠-溴化钠-硫酸铈铵”为振荡体系，采用非线性化学指纹图谱技术，利用最小二乘法建立特征参数与掺杂尿素含量的定量评价模型，对婴幼儿配方奶粉中掺杂的尿素进行定量分析和质量评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所用婴幼儿配方奶粉（简称“奶粉”）由陕西省产品质量监督检验研究所提供。4 种品牌奶粉样品分别为奶粉1#、奶粉2#、奶粉3#和奶粉4#，奶粉5#与奶粉1#同品牌但不同批次。

1.00 mol/L硫酸、1.00 mol/L丙二酸、0.01 mol/L溴化钠、0.80 mol/L溴酸钠、0.05 mol/L硫酸铈铵溶液、尿素（均为分析纯） 天津市福晨化学试剂厂；水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

MZ-1B-2型非线性化学指纹图谱测定仪 湖南尚泰测控科技有限公司；217型复合甘汞电极、213型金属铂电极、BS 224 S型电子天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 奶粉标准样品系列配制

取6 份奶粉1#，分别加入0、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00 mg的尿素，配成掺杂尿素的奶粉标样，每份标样的总量为1.00 g。奶粉2#、奶粉3#、奶粉5#掺杂尿素的奶粉标样的配制方法同奶粉1#。

1.3.2 标样定量信息测定与回归方程模型建立

取1.00 g上述奶粉1#标样于反应器中，分别加入1.00 mol/L硫酸溶液25.00 mL、1.00 mol/L丙二酸溶液10.00 mL、0.05 mol/L硫酸铈铵溶液3.00 mL、0.01 mol/L溴化钠溶液1.00 mL和15.00 mL蒸馏水。盖好带注射孔和电极的反应器盖。打开恒温系统调节反应器，温度设为50 ℃，恒速搅拌设定为800 r/min，点击菜单采集数据，搅拌到3.00 min时用注射器迅速加入0.80 mol/L溴酸钠溶液5.00 mL。记录E-t曲线至电位E不再随时间t变化为止。所测奶粉指纹图谱的定量参数如诱导时间、最大波幅和振荡周期等由Matlab（Ver.7.11.2010b）软件处理。采用最小二乘法来建立定量参数与掺杂尿素含量之间的一元线性回归模型。

1.3.3 未知试样的测定

准确称取1.00 g奶粉样品于反应器中，采用1.3.2节方法，测定指纹图谱，利用Matlab软件处理所测奶粉指纹图谱的诱导时间，通过所建立的一元线性回归模型计算奶粉中掺杂的尿素含量。

2 结果与分析

2.1 非线性化学指纹图谱技术的分析原理

根据化学振荡原理，在酸性介质封闭条件下，丙二酸为有机底物，为氧化剂，Ce4+为催化剂，构成稳定的H2SO4-振荡体系。在反应过程中被还原为Ce3+，被还原为，其中HBrO2具有自催化作用，它的生成与消失影响着的进一步还原产物Br-和金属离子氧化产物Ce4+浓度的变

化，随着Ce4+浓度消耗和Br-浓度累积至一定值，能引发体系一系列氧化-还原反应的发生，当Ce4+浓度累积和Br-浓度消耗至一定值时，同样引发体系一系列氧化-还原反应的发生，于是形成体系氧化还原值的周期性变化[25-26]。在封闭体系中，没有外界能量的补充，随着体系内能量不断耗散，振荡最终停止。由于不同的奶粉组成成分和含量不同，当将其加入到此振荡体系时，使有机底物的组分发生改变，从而对振荡体系会起到促进或抑制作用。不同奶粉因其化学成分的氧化还原性存在差异，其促进或抑制作用不同，因此所得相应奶粉的非线性化学指纹图谱的形状和可量化信息存在差异。

2.2 奶粉非线性化学指纹图谱的基本信息和重复性

图1 奶粉4#非线性化学指纹图谱的基本特征信息（A）及重复性（B）Fig. 1 Basic characteristic information about the nonlinear chemical fingerprint of milk powder 4# (A) and reproducibility (B)

非线性化学指纹图谱拥有丰富的直观信息和可量化信息，其直观信息中包含诱导曲线、波动曲线、波峰形状和电位漂移曲线等[22]；而可量化信息包括许多特征参数，如图1所示，其中诱导时间（tind）是指第1波峰开始出现的时间[14]。由图1B可知，对于同一品牌奶粉，因其成分的组分和含量一致，故指纹图谱的重复性很好，相似度很高。

2.3 奶粉掺杂尿素定量测定结果

由于不同品牌奶粉的成分种类和含量存在差异，当掺杂不同量的尿素时，相应的奶粉指纹图谱表现出相应的差异。其定量信息如诱导时间、停波时间、波动周期或最大波幅等与奶粉中尿素含量之间可能呈线性关系。这要根据实际样品，利用非线性化学指纹图谱技术测定其非线性化学反应的动力学信息之后来决定。本实验以奶粉1#为检测样本，结果表明，当尿素含量在0～40.00 mg/g时，奶粉1#的指纹图谱的定量参数诱导时间与尿素含量呈良好的线性关系，当尿素含量超过40.00 mg/g时，不呈线性，如图2所示。

图2 奶粉1#中掺杂的尿素含量对非线性化学指纹图谱诱导时间的影响Fig. 2 Effects of urea content in milk powder 1# on induction time of nonlinear chemical fingerprint

当向纯奶粉中加入不同含量的尿素时，其掺杂奶粉指纹图谱特征与纯奶粉的特征明显不同。为此，本实验通过向奶粉中加入不同含量的尿素，测定掺杂奶粉的指纹图谱，利用这些指纹图谱的特征参数与掺杂奶粉中尿素含量之间的线性回归关系模型，对相应奶粉进行鉴别和掺杂含量的定量评价。

2.4 不同掺杂量对奶粉指纹图谱特征信息的影响

图3 尿素的含量对奶粉1#非线性化学指纹图谱诱导时间的影响（a）及局部图形（b）Fig. 3 Effects of urea content on induction time of nonlinear chemical fingerprint of milk powder 1# and corresponding local graph

图3 b为图3a相应指纹图谱分别在180～300 s时的部分诱导曲线和波动曲线图，由图3b可知，随着尿素含量的增加，相应的指纹图谱的诱导时间在逐渐延长，同时每个图谱出第1个峰的时间也存在差异，图中如箭头所示。这是因为随着尿素加入量的增加，改变了反应底物的组分，尿素含量对非线性化学反应的抑制作用在增强，从而导致相应的诱导时间存在差异。当奶粉中掺杂的尿素含量在0～40.00 mg/g范围时，奶粉1#的非线性化学指纹图谱的特征参数诱导时间与相应奶粉中掺杂尿素的含量之间呈良好的线性关系，其回归方程为tind=0.115 2C+ 249.07，相关系数R2为0.998 7。这些信息为测定奶粉中掺杂的尿素含量提供了必要条件。

2.5 定量实验结果

图4 尿素的含量对奶粉2#（A、B）、3#（C、D）非线性化学指纹图谱诱导时间的影响Fig. 4 Effects of urea content on induction time of nonlinear chemical fingerprint of milk powder samples 2# and 3#

为了进一步验证实验的可行性和可靠性，分别取奶粉2#和奶粉3#，人为向奶粉中分别加入0、5.00、10.00、20.00、30.00 mg和40.00 mg尿素，每份奶粉标样的总量为1.00 g，按照1.3.2节，奶粉2#和奶粉3#中尿素掺杂量对指纹图谱特征信息的影响分别见图4（图中的箭头表示第1个峰的位置）。当奶粉2#和奶粉3#分别掺杂尿素含量在0～40.00 mg/g范围时，相应奶粉指纹图谱诱导时间与尿素含量之间的回归方程分别为tind=-0.420 6C+257.3和tind=-0.774 5C+273.10，相关系数R2分别为0.999 5和0.996 6，如表1所示。

表1 利用非线性化学指纹图谱法检测奶粉中掺杂的尿素含量检测结果Table 1 Results of urea determination in adulterated milk powder samples by nonlinear chemical fingerprint method

图5 尿素含量对奶粉5#非线性化学指纹图谱的影响Fig. 5 Effects of urea content on nonlinear chemical fingerprint of milk powder 5#

取奶粉5#，人为向奶粉中分别加入6.00、12.00 mg/g和23.00 mg/g尿素，每个样品平行测定3 次。奶粉5#中分别掺杂6.00、12.00 mg/g和23.00 mg/g尿素的非线性化学指纹图谱见图5。这进一步说明混合奶粉的重复性非常好。由验证实验可知，利用非线性指纹图谱法测定奶粉中掺杂尿素的含量，其方法可行，同时此方法用回归方程代替长期保存的同品牌奶粉标样，当检测与奶粉标样同品牌不同批次的奶粉时，只要利用非线性化学指纹图谱法测出该品牌奶粉的图谱信息，代入相应拟合的方程，就可以对该奶粉的质量进行分析鉴定。

2.6 非线性化学指纹图谱法测定奶粉中掺杂的尿素含量利用非线性化学指纹图谱法，按照1.3.2节，测定奶粉1#中掺杂不同量尿素的非线性化学指纹图谱，通过相应的拟合方程，可求出相应奶粉中掺杂的尿素含量，如表2所示。

表2 利用非线性化学指纹图谱法检测奶粉1#中掺杂的尿素含量Table 2 Results of urea determination in adulterated milk powder 1# by nonlinear chemical fingerprint method

由表2可知，测定结果的相对标准偏差不大于1.82%，说明该方法的精确度较好，回收率在95.48%～104.06%之间，说明该方法的准确度较高。此方法完全可用于奶粉中尿素含量的检测，其方法可行，同时还可以为样品中其他掺杂物质的含量测定提供参考。

2.7 奶粉中掺杂尿素含量的检出限结果

根据检出限的计算方法[12,27-29]，检出限为3 倍噪声大小响应信号的待测组分的量这一定义，本研究中选择了多种不同品牌的奶粉进行大量实验，每个样品平行测定10 次，奶粉中掺杂的尿素含量的检出限基本是在1.1×10-4～4.5×10-4mg/g之间。由表3可知，计算所得检出限分别为奶粉1# 3.3×10-4mg/g，奶粉2# 4.5× 10-4mg/g，奶粉3# 1.1×10-4mg/g。实际上，乳中尿素的含量一般在620.00 mg/L以内为正常[30]，于是在本研究中，当奶粉中掺杂尿素含量在0.62 mg/g以下时，将该掺杂奶粉作为纯奶粉处理。基于此，利用非线性化学指纹图谱法对奶粉中掺杂尿素进行定量分析和质量评价，方法可行，并且有较高的准确度和精密度。另外本方法也为配方乳粉中添加的尿素含量的检测提供了依据。

表3 奶粉中掺杂尿素含量的检出限Table 3 Limits of detection for urea content in adulterated milk powder samples (n = 10)

2.8 方法的特异性结果

通过大量实验发现，向混合奶粉（尿素和奶粉的混合物）中加入一定量的三聚氰胺进行干扰，当混合奶粉中掺杂的尿素含量不变，同时三聚氰胺的含量小于5×10-5mg/g时，对实验没有影响；当三聚氰胺的含量不小于5×10-5mg/g时，对实验有一定的影响，并且通过非线性化学指纹图谱方法，能把掺有尿素的奶粉和掺有三聚氰胺的奶粉区别开。

3 结 论

奶粉中掺杂的尿素含量与相应掺杂奶粉非线性化学指纹图谱的定量参数如诱导时间之间存在定量关系，利用奶粉标样非线性化学指纹图谱信息拟合的线性回归方程，可以测定同品牌不同批次奶粉中掺杂的尿素含量。实验结果表明，提出的非线性化学指纹图谱法具有较高的精密度和准确度，同时此方法对于同一品牌的奶粉样品，可用建立的回归方程代替长期保存的奶粉标样。此外，与其他分析方法相比，该方法具有操作简单、样品不用预处理和分析成本低廉的优点，同时为乳粉中掺杂的尿素含量测定提供了一种新方法。

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Determination of Urea Content in Adulterated Milk Powder by Nonlinear Chemical Fingerprint Method

MA Yongjie1,2, BAO Hongliang3, DONG Wenbin2
(1. College of Food and Drug, Luoyang Normal University, Luoyang 471000, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China; 3. College of Mathematical Sciences, Luoyang Normal University, Luoyang 471000, China)

The urea content in adulterated milk powder was rapidly determined by nonlinear chemical fingerprint method using a reaction system consisting of sulfuric acid, malonic acid, ceric ammonium sulfate, sodium bromate and sodium bromide. Firstly, urea was added at different levels to milk powder to obtain adulterated milk powder standard samples each weighing 1.00 g. The nonlinear chemical fingerprint was recorded for each milk powder standard sample, and a linear relationship between the induction time and the urea content was established. Then, the urea content in milk powder was calculated by the least square method. The results showed that urea contents within the range of 0–40.00 mg/g in milk powder and induction time values displayed a good linear relationship with correlation coefficients equal to 0.996 6 and 0.999 5. The recoveries were 95.48%–104.06%, the relative standard deviations (RSDs) were not greater than 1.82%, and the detection limits (LODs) for milk powder samples 1#, 2# and 3# were 3.3 × 10-4, 4.5 × 10-4and 1.1 × 10-4mg/g, respectively. The method developed has the advantages of good accuracy and simple operation. It is a practical and feasible method for determining the urea content in milk powder.

nonlinear chemical fingerprint; milk powder; linear regression method; urea quantitation

10.7506/spkx1002-6630-201716047

TS252

A

1002-6630（2017）16-0292-06

马永杰, 包洪亮, 董文宾. 利用非线性化学指纹图谱法检测奶粉中掺杂的尿素含量[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 292-297. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716047. http://www.spkx.net.cn

MA Yongjie, BAO Hongliang, DONG Wenbin. Determination of urea content in adulterated milk powder by nonlinear chemical fingerprint method[J]. Food Science, 2017, 38(16): 292-297. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201716047. http://www.spkx.net.cn

2016-10-20

陕西省科技统筹创新工程计划项目（2011KTCQ03-08）；“十二五”农村领域国家科技计划项目（2012BAD12B07）；陕西省教育厅服务地方项目（15JF009）；河南省高等学校重点科研项目（18A550012）

马永杰（1979—），女，讲师，博士，研究方向为食品检测技术与食品功能因子及保健机理。E-mail：mayongjie113@163.com