偏光显微镜下毛竹材纤维细胞的分类1)

刘嵘

(国际竹藤中心，北京，100102)

安鑫

(中国林业科学研究院)

韦鹏练

(广西大学林学院)

费本华

(国际竹藤中心)

偏光显微镜下毛竹材纤维细胞的分类1)

刘嵘

(国际竹藤中心，北京，100102)

安鑫

(中国林业科学研究院)

韦鹏练

(广西大学林学院)

费本华

(国际竹藤中心)

为更快捷简便地研究毛竹(Phyllostachysedulis(Carr.) J. Houz.)材纤维细胞特性，通过分析毛竹纤维细胞的偏光显微镜图像，对照电子显微镜的壁层结构形貌，提出了一种简单的分类方法。对纤维细胞特征进行定性分析后，依据厚壁层数量将竹纤维细胞分为3种类型，并将侧方纤维帽分为3个区域，统计各类型纤维细胞在各区域内的分布规律。此分类方法可作为一种简单快速的筛选和预判手段，有助于对纤维细胞进行更深层次的研究。

偏光显微镜；毛竹；细胞壁；竹纤维；细胞分类

毛竹生长迅速、资源丰富，且易于可持续管理，是一种性能优异、用途广泛的木质材料，其主要组成与利用部分是纤维细胞，它的微观构造与性质决定了竹材的物理力学等宏观表现[1]。国内外对竹纤维细胞壁的解剖结构、化学成分、微纤丝排布以及壁层分布规律等进行了大量的研究[2-4]。实际上毛竹纤维细胞之间特征不尽相同，进行细胞壁深入研究时也不宜对它们一概而论，因此有必要对竹纤维细胞进行快速分类。偏光显微镜(PLM)制样简单且使用方便，在晶体光学性质研究方面颇具优势，而竹材纤维具有相应的晶体特性，可以借助偏光显微镜研究其微细结构与特征[5]。笔者根据毛竹纤维细胞的PLM图像特征，定性分析细胞形态与厚壁层数等分布规律，并进行了简单分类，为深入研究毛竹纤维细胞特性提供一种简便易行的观测与筛选分类方法。

1 材料与方法

4年生毛竹，采自安徽省黄山市的太平公益林场，从竹秆露出地面记为第1节，取第10节中部作为试验材料。

PLM和LM(普通光镜)试样制作：竹块软化后，用滑走切片机(M2000R)制成厚度为10 μm的横纵切片；小竹条用等量的CH3COOH和H2O2混合液在试管中浸泡，于60 ℃水浴锅中加热18 h后取出，用蒸馏水洗至pH=7.0，得到离析后的单根纤维。切片与单根纤维均制成临时封片。

FEG-SEM试样制作：5 mm (长)×10 mm (宽)×10 mm(厚)竹块，一组用常规电镜制样方法(干燥)，另一组先经冷热交替处理，再进行干燥，最后用导电胶贴于样品托上离子溅射镀膜。

样品载玻片在普通光镜下观察，再将相同样品载玻片置于偏光显微镜(ML9000，MEIJI)载物台上，起偏角度数设为90°，检偏角为0°，外接CCD摄像头；喷金后的样品在场发射环境扫描电子显微镜(XL 30 ESEM FEG，FEI Company, Hillsboro, OR)下观察。试验环境条件为室温(20±3)℃，湿度(65±5)%。

2 结果与分析

2.1 PLM下纤维细胞特征

2.1.1 纤维细胞的PLM图像原理

纤维的PLM图像对壁层结构特点的定性认识有重要意义，尹思慈等[6]利用偏光显微镜测定了木材纤维胞壁的纤丝角，也有研究[7]利用单根纤维纵向PLM图像来辨认纺织用聚酯类纤维特征，还有学者[7]通过PLM来间接估测棉纤维的成熟度。

纤维素是构成竹纤维细胞壁的主要组分之一，是由许多D-吡喃葡萄糖苷通过1-4β苷键连接起来的线形高分子化合物[9]，具有能使光线的折射指数随偏振光方向改变的晶体结构。旋转一束普通偏振光的偏振方向，光振动透过竹纤维后仍会进一步透过正交偏光镜，具有相同频率和固定相位差的两束折射光在显微镜内产生光的干涉[10]，可由此观察到竹纤维纵场面上外观形态的干涉条纹。竹纤维的双折射率决定光程差，光程差进一步决定干涉条纹的颜色。此外，由Liese[11]和Wain[12]等学者提出的竹纤维精细结构模型并结合纤维素的晶体特性可知，竹纤维细胞的横截面上存在圆周或径向取向，因此在正交偏光显微镜下将会出现消光黑十字叉的图案(图1e)。纤维纵切面上，不同位置所呈现的颜色段不同，但颜色分段的位置基本一致。纤维细胞纵向上各层的颜色特征较鲜明(图1c)，纤维外缘亮度最大，这与毛竹纤维最外层细胞壁的双折射特性有一定关系。

a、b分别为竹纤维纵切面的LM和PLM图像(20×)；c为单根纤维的PLM图像(20×)；d、e分别为竹纤维细胞的LM和PLM图像(40×)。

2.1.2 纤维细胞的PLM图像特征

毛竹茎秆主要由承力的纤维厚壁细胞和起连接作用并传递载荷的薄壁细胞基体组成，细胞横切面近似圆形。图2中，维管束厚壁细胞横截面在偏光显微镜下出现消光黑十字叉。细胞因各壁层的折射率不同，视觉感觉有部分以胞腔为中心的同心环状突起。

维管束中细胞壁为厚薄交替的多层结构[13]，厚层占大部分，其纤丝角与细胞长轴夹角较小，微纤丝对偏振光的双折射率较低，出现图2中较宽的暗环；而薄层纤丝角与细胞长轴近乎垂直，在偏振光下有高双折射率，观测到细的亮环，各壁层的双折射特性共同构成了偏振光图像中明暗交替的同轴圆环。各纤维帽中的细胞尺寸由导管附近至维管束外缘有变大的趋势，且细胞壁层数也有增多的趋势。靠近木质部的细胞小，胞壁分层较少，多为单壁；而多壁层细胞主要分布在侧方纤维帽外周，但在其他位置甚至是靠近后生木质部导管处也有零星分布。纤维细胞在生长发育过程中，腔径比逐渐减小，壁腔比逐渐增大。靠近木质部和韧皮部处的直径较小的纤维细胞最先成熟，细胞壁增至最大厚度[14]。

a.维管束PLM图像(10×)(P为初生韧皮部，Px为原生木质部，Mx为后生木质部)； b. 侧方纤维帽PLM图像(20×)；c.侧方纤维帽中间区域的纤维细胞(40×)；d. 侧方纤维帽外围靠近基本薄壁组织的细胞(60×)。

图2 偏光显微镜下的毛竹纤维细胞

2.2 纤维细胞分类统计

为统计维管束中细胞壁的壁层分布特征，参考Gritsch和Murphy[15]提出的分类方法，根据厚壁层数将毛竹纤维细胞分为3种类型(图3)。第一类为Ⅰ型单厚壁型，只有一层厚壁，仅观测到一层较宽的黑环；第二类为Ⅱ型细胞，厚壁层数在2～4层范围内；第三类为Ⅲ型多厚壁细胞，这类细胞可观察到超过4层的厚壁层。

与同类型细胞在电子显微镜下的壁层形貌对比发现，PLM与SEM的观测结果一致，但前者效果更直观。用常规方法制样的竹块，在电子显微镜下也能观察到Ⅰ型和Ⅱ型的细胞形貌，但对于Ⅲ型细胞的寻找有难度。SEM样品经冷热交替处理后，部分壁层间发生剥离，方能看到多壁层结构；此外，由于不确定是否所有的壁层之间都完全发生剥离，因而无法准确判断细胞壁层数量。相比之下，通过PLM则获得纤维细胞的外观形态和结晶特征的图像，且制样相对简单，在合适的参数设置和高分辨率下，Ⅲ型细胞的多壁层结构和相应晶体特性可得到较好的体现。

将侧方纤维帽分为3个区域，统计3种类型的纤维细胞在各区域的分布规律。如图4所示，Ⅱ型细胞在图中3个区域均有分布，在区域2中占主体。Ⅰ型单层厚壁细胞在韧皮部和木质部附近分布最多，在其他区域也有极少量分布。Ⅲ型多壁层细胞主要集中在纤维帽的外缘，与少量Ⅱ型细胞共同构成区域3。

3 结论与讨论

毛竹材纤维细胞的PLM图像特征很大程度上体现了纤维的外观形态和整体结晶特性，以细胞厚壁层数对细胞类型进行分类与统计，是对竹纤维细胞特征的一种简单直观分析方法。3种类型纤维细胞在各区域内的分布规律为：Ⅲ型多厚壁层细胞(壁层≥5)主要集中在纤维帽的外围，但在其他位置甚至是靠近后生木质部导管处也有零星分布。Ⅱ型细胞(壁层为2～4层)主要分布在区域2中，Ⅰ型单层厚壁细胞在韧皮部和木质部附近分布最多。

a、b、c分别为类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ的示意图；d、e、f分别为类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ的偏光显微镜图像；g、h、i分别为类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ的扫描电镜图像。

图3 毛竹纤维细胞分类

图4 侧方纤维帽中各类型细胞的分布

相比其他能观测到毛竹细胞壁多层结构特征的工具而言，偏光显微镜使用便捷，制样简单，竹纤维的整体结晶特性得到较好的体现。但是在对获得的偏光显微镜图片进行后期处理与分析的过程中，对图像清晰度与颜色呈现等有一定的要求，尤其是统计细胞类型时需要较高的图像分辨率。本实验中，区域1由于细胞过于密集，部分的边界清晰度不够，给壁层识别与数量统计带来一定难度。另外，研究与分类统计对象可以延伸至竹间不同部位的更多细胞。再者，对于样品处理、偏光参数调整和选择辅助波片等方面还须进一步探讨，对竹纤维纵切面以及基本组织中薄壁细胞的研究也有待深入。

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[5] 阮锡根，江泽慧，陶灵虎.用结晶学的观点研究纤维细胞壁的结构及形成机理[J].东北林业大学学报，2001,29(2):1-3.

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Classifying Fiber Cells in Moso Bamboo with PLM//

Liu Rong

(International Center for Bamboo and Rattan, Beijing 100102, P. R. China);

An Xin

(Research Institute of Forestry, CAF);

Wei Penglian

(Guangxi University);

Fei Benhua

(International Center for Bamboo and Rattan)

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(8)：57-60,65.

The experiment was conducted to make an easy tryout in the characteristics of bamboo fiber cells research. Polarization light microscope (PLM) images of bamboo fiber cells were analyzed comparing with the morphology of multilayered cell wall structure by field-emission gun scanning electron microscope (FEG-SEM). A simple method of cell classification was proposed to compile statistics of regional distribution of each type of fiber cells, thus lateral fiber caps were divided into three categories and three regions, respectively, according to the number of thick wall layers of each cell.

Polarizing light microscope (PLM); Moso bamboo; Cell wall; Bamboo fiber; Cell classification

1)国家自然科学基金面上项目(31370563)。

刘嵘，女，1988年6月生，国际竹藤中心，博士研究生。E-mail：rowan_lr@163.com。

费本华，国际竹藤中心，研究员。E-mail：feibenhua@icbr.ac.cn。

2017年3月6日。

S781

责任编辑：戴芳天。