氮源对酒精酵母的影响及复合营养剂在酒精发酵中的应用

董克芝，陈春路，张德省，刘 辉，施 清

(1.中粮生化能源（肇东）有限公司，黑龙江绥化152000； 2.国家酵母技术研究推广中心，湖北宜昌443003)

氮源对酒精酵母的影响及复合营养剂在酒精发酵中的应用

董克芝1，陈春路1，张德省1，刘 辉1，施 清2

(1.中粮生化能源（肇东）有限公司，黑龙江绥化152000； 2.国家酵母技术研究推广中心，湖北宜昌443003)

概述了酒精酵母、原料的化学组成和酒精发酵时酵母的营养需求，对尿素作为氮源产生氨基甲酸乙酯（EC）的过程进行分析，阐述了一种酒精发酵复合营养剂对酒精酵母的影响和使用该产品带来的指标优化。

酒精酵母； 酒精发酵； 发酵促进剂； 复合营养； 食品安全

酵母，作为一种常见兼性厌氧微生物，大量用于面食、酿造、保健等领域。用于酒精发酵的酿酒酵母俗称酒精酵母，该类酵母要求具备较高的耐渗透压、耐受一定的底物（糖）和产物（酒精）、低产副产物能力。随着酒精行业的不断发展，传统的酒精酵母斜面扩培技术早已被酒精高活性干酵母所取代。可以说，具备上述特性的酒精高活性酵母早已成为现代酒精工业生产中所不可或缺的一部分。

然而，纵使各大企业采用了同质化的酒精酵母，但是企业间因发酵水平的不同产生的经济效益也不尽相同。这其中，既有企业发酵设备的差别，也有发酵方式的不同，更有工艺条件控制的千差万别。发酵设备作为企业经营者最直接的资本输出，受资金和设备发展影响巨大；而发酵方式往往涉及设备改造，受发酵设备影响较大，在此不做具体分析；而工艺条件控制受资金和设备的影响小得多，更多的与工艺人员自身技术和理解相关，具有更多的优化空间。酒精发酵的关键性工艺条件包括营养、温度和保护剂三大类。本文具体就营养一大类中的氮源进行分析，阐述复合氮源营养对酒精酵母的影响，并介绍一种复合氮源营养剂在酒精发酵中的可行性。

表1 酒精酵母的元素种类及含量[1]

1 酒精酵母、原料的组分

酒精酵母属于酿酒酵母种之一，酒精酵母的化学组成与酿酒酵母也高度相似（功能性酿酒酵母除外），酒精酵母的化学组成见表1。

酿酒酵母的营养需求极其复杂，酒精酵母的化学组成成分超过15种[1]，分为大量元素，其他元素以及微量元素，大量元素包括常见的C、H、O、N、P等，其他元素包括Ca、K、Mg、Na、S等，而微量元素则包括Fe、Cu、Zn、Co等。其中，大量元素中的C、H、O作为碳水化合物的主要成分，是原料的主要成分。而N、P和其他元素以及微量元素由于本身含量较低且成本较高而往往被弱化或忽视，尤其以氮源的选择和利用为甚。大量研究表明，酵母作为一个类群能够利用许多不同的化合物作为氮源，已经用硝酸盐、亚硝酸盐、氨、氨基酸和尿素做了大量的实验。这些化合物之间是可以互相转换的[2]。酵母菌（真菌）利用铵盐作为氮源。如果以硝酸盐、亚硝酸盐为氮源，则首先转化成铵根，铵根参与谷氨酸的合成，最后进入细胞氨基酸库，进入氮源代谢。而尿素及铵盐作为氮源，则必须经过水解成铵根后供谷氨酸代谢。在以上氮源代谢过程中，涉及到的非氮源物质主要有酶以及酶激活剂，这些物质往往需要额外的添加并且必须适量，否则有重金属中毒的风险[4]。

目前，用于发酵酒精的原料主要分为三大类：淀粉质、糖质和纤维质，其中，淀粉质和糖质原料是目前世界范围内使用最广，研究相对成熟的发酵原料。其中，我国发酵酒精的主要原料为淀粉质原料和少量的糖质原料，淀粉质原料主要分为玉米和薯类。玉米原料的化学组成见表2。

木薯原料的化学组成见表3。

需要说明的是，以表2、表3给出的数值仅仅是代表值，受地域、种类影响，玉米、木薯的化学组成比例会有不同。

表2 玉米的化学组成 (%)

表3 木薯的化学组成 (%)

从表2、表3可以看出，酿酒酵母的氮含量在7.5%～10%之间，若以粗蛋白含氮量计算，则酿酒酵母的粗蛋白含量在46.875%～62.5%之间，这个数值远远高于玉米或木薯中蛋白质的含量（假设该物质中的蛋白质全部可被酵母利用）。所以，在酒精发酵中补充氮源，并且补充可被酵母完全利用的可同化氮是非常必要的。

2 氮源的分类

目前，用于现代生物发酵的氮源分为两大类：无机氮和有机氮。无机氮是植物、土壤和肥料中未与碳结合的含氮物质的总称。主要有铵态氮、硝态氮和亚硝态氮等，这些氮源主要来自化工生产，且来源广泛，价格相对较低，使用效果显著；而有机氮的概念恰恰相反，有机氮是植物、土壤和肥料中与碳结合的含氮物质的总称，如蛋白质、氨基酸、酰胺等。这些氮源的获得随着现代生物工程的发展而为人们所熟悉，获得途径较为困难，价格较高，但使用效果具有针对性。有机氮根据来源，分为三大类：动物有机氮、植物有机氮和微生物有机氮。动物有机氮主要有牛肉膏、蛋白胨、鱼粉等，这些物质在生物工程领域被广泛利用，但受认证和风俗禁忌影响，并不能为全世界所接受，若用于酒精生产，一定程度限制了酒精的销售范围；植物有机氮包括黄豆饼粉（最常用）、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉等，这些物质虽来源广泛，但往往是食品加工的废弃物，存在着食品安全的隐患，如果要加工为食品级原料，则成本会成倍上升；微生物有机氮，目前使用最多的是酵母有机氮。酵母是第一个为人类所完全测序的微生物，也是目前被人类所广泛熟知和接受的。在几乎所有国家和地区，酵母被归为食品或食品添加剂一类，不论从风俗禁忌还是法律法规都完全符合安全氮源的要求。

3 不同氮源选择对酵母及酒精发酵的影响[5-7]

真菌对氮源的利用类型是有限制的，除目前没有明确的证实真菌能够固定分子氮外，大部分真菌能够同时利用硝酸盐、铵盐和有机氮，绝大部分真菌不能利用硝酸盐，仅有少部分真菌只能利用有机氮源。不同氮源在酵母中的代谢图见图1。

图1 不同氮源在酵母中的代谢图

目前，我们使用的铵盐和尿素都是需要经过酵母菌的一级或多级代谢形成谷氨酸之后才能进一步为酵母所利用，而谷氨酸的合成本身是一个消耗能量的过程，而酵母抽提物则不同，氨基酸大量存在于酵母抽提物之中，酵母菌利用氨基酸不需要辅酶（NADPH等）、微量元素（Mn、Fe、Cu、Mg等）参与，也就是不消耗ATP，而ATP的合成需要依靠呼吸作用，呼吸作用需要消耗物质，所以使用酵母浸出物（有机氮）可避免因ATP的合成而消耗原本应该转化为酒精的原料，使得这些原料避免被酵母繁殖而消耗，转为酵母菌的酒精发酵底物，同时避免了酒精发酵产生大量的热量，可节约冷却水。

4 尿素生成氨基甲酸乙酯（EC）的代谢途径

在酒精发酵过程中，尿素的来源主要有两种：一是在发酵前作为氮源添加入发酵液中；二是酵母吸收氮源时降解精氨酸生成。当酵母细胞内尿素含量过高来不及吸收利用时，会有一部分尿素被转运至细胞外。分泌到细胞外的尿素和发酵前添加的尿素都有可能和发酵液中的乙醇反应生成氨基甲酸乙酯。氨基甲酸乙酯具有一定的神经毒性、强烈的肺毒性和较强的致癌性。在食用酒精中，长期摄入微量的胺（氨）类物质也会显著增加各种癌症的发病率。胺（氨）类物质的存在，严重影响了我国传统发酵食品的安全性，限制了我国传统发酵食品的出口贸易和食品文化影响力。

酿酒酵母可同化氮源（YAN）包括铵盐和含α-氨基氮的氨基酸（脯氨酸除外，它在有氧发酵时不能作为酵母的氮源）。酿酒酵母对氮的吸收分两步：首先通过特定的透性酶吸收有效的氮源；其次降解氮源参与氮代谢途径。

当培养基中同时存在多种氮源时，酿酒酵母会优先利用丰富型氮源如谷氨酰胺、铵盐、谷氨酸、天冬酰胺等。只有在培养基中缺少上述丰富型氮源或在丰富型氮源已被完全利用的情况下，酿酒酵母才会开始利用精氨酸、尿素、尿囊素、GABA和脯氨酸等贫乏型氮源。这种由缺失丰富型氮源而引起的氮源对贫乏型氮源的转录水平上的去阻遏现象就称之为氮代谢阻遏效应（Nitrogen catabolite repression，NCR）。研究发现，酿酒酵母对几种氮源利用的先后顺序为天冬氨酸/谷氨酰胺＞铵盐＞谷氨酸＞尿素＞GABA＞脯氨酸，即：酵母浸出物＞铵盐＞尿素。

研究指出，酵母是不能直接利用尿素分子的，酵母只能利用铵态氮作为自身氮源，所以尿素在进入发酵系统时，必须经过下面的步骤才能为酵母所利用。

酵母利用尿素的氮同化作用途径如下：

尿素在酸/碱/尿酶的作用下首先缓慢分解为（NH4）2CO3和 CO2，（NH4）2CO3不稳定，分解为 NH4+和CO2：

NH4++α-ketoglutarate（α-酮戊二酸）+NADPH↔ glutamate（谷氨酸）+NADP+，反应由NADP相关的谷氨酸脱氢酶（NADP-GDH）催化发生。

Glutamate（谷氨酸）+NH4++ATP→glutamine（谷氨酰胺）+ADP+Pi，反应由谷氨酰胺合成酶（GS）催化发生。

Glutamate（谷氨酸）+NAD+↔ NH4++NADH+α-ketoglutarate（α-酮戊二酸），反应由依赖于NAD的谷氨酸脱氢酶（NAD-GDH）催化发生。

Glutamine（谷氨酰胺）+α-ketoglutarate（α-酮戊二酸）+NADH→2glutamate（谷氨酸）+NAD+，反应由谷氨酸合成酶（GOGAT）催化发生。

以上反应的各步骤涉及到了ATP和NADPH的转化，也就是说需要能量的支持。再看酵母浸出物的组分。

作为各大酒精企业的后盾，安琪酵母股份公司已经为各行业同仁找到了一条有效的途径。安琪发酵促进剂是由酵母浸出物、酶制剂和营养盐配制的一种复合型产品，主要用于酒精发酵过程。适用于淀粉质（玉米、木薯、小麦等）、糖质（蔗糖、糖蜜等）、纤维素（甜高梁秸杆等）为原料的酒精发酵过程。它能够促进酵母生长，提高酵母活力；是一种高效营养助推器，为酒精酵母提供天然、安全的生物营养源；加快酒精发酵速度，缩短发酵周期；总之，该产品能够丰富酒母繁殖环境，提高酵母发酵能力。图2为酵母由尿素和乙醇反应生成氨基甲酸乙酯示意图。

5 安琪发酵促进剂在酒精发酵中的应用

在酒精发酵过程中，酵母菌处于主体地位，酵母的生长和乙醇生成是紧密联系在一起的，所以有必要在发酵过程中加入相应的酵母必需物质，创造条件使酵母菌维持旺盛的生长繁殖能力，避免发酵不彻底。对于酒精浓醪发酵而言，发酵醪液中的酵母所需营养成分显得格外重要。

图2 酵母由尿素和乙醇反应生成氨基甲酸乙酯示意图[3]

酒精是酵母的强毒性代谢产物，一方面酒精抑制酵母对氨基酸的吸收，影响酵母的生长、繁殖和代谢，进而抑制酒精的生成；同时酒精还会破坏细胞膜中的磷脂双层结构，使细胞内的组分流失；另一方面，酒精对酒精脱氢酶也有抑制作用，大大增加了乙醛的毒性。

研究发现，在高浓度发酵条件下，补充不饱和脂肪酸和甾醇等这些影响细胞膜活性的存活因子，可以抵消酒精的破坏作用，使细胞膜恢复原有的通透性和流动性，从而稳定和提高酒精发酵产率。同时结果发现，吸收了存活因子后，酵母细胞在发酵过程中耐受酒精的能力有很大提高。

磷脂是细胞膜的最重要成分。有研究发现，在酒精发酵过程中，当细胞中磷脂酰肌醇[Phosphatidylinosito(PI)]含量高时，酵母菌产酒精的速率和培养基中积累的最终乙醇产量都较高。这表明PI对于酵母细胞产酒精速度和高产酒精起到很重要的作用[4]。

复合酒精发酵营养剂的出现是对该领域空白的填充。目前，我厂引进了安琪发酵促进剂作为氮源补充。安琪公司通过对酵母组分的细致研究，对酒精酵母工作机制的科学分析，合理配比，开发了以复合营养，兼顾有机氮、无机氮，增加速效、缓释氮源的新型配方。经小试、中试和大生产试验三级试验证明，该产品完全符合食用酒精浓醪发酵营养的要求。

6 采用复合酒精发酵营养剂的直接指标优化

采用安琪发酵促进剂并进行工艺微调后，最直接的表现是：①酵母的细胞数有一定程度的下降，但是出芽率较对照有了明显提升；细胞形态较之前更加饱满、细胞膜明显增厚，内含物丰富；②生酸值降低了约10%，尤其是挥发酸，降低幅度达到50%；③降低了原料处理的蒸汽消耗，降低了由于高温蒸煮造成的糖分损失；④取消了硫酸的添加，消除了危险源和酸对设备的腐蚀影响；⑤提升了成品酒精的品质。

7 总结

纵观酒精发酵工业这一百多年以来，技术工艺渐趋成熟，随着科技的进步，浓醪发酵是酒精发酵工业的必然发展目标和方向，同时食品安全生产的管理理念必然贯彻在食用酒精生产的整个环境中，积极寻找安全营养产物，显得尤为重要。添加酒精发酵复合营养剂，可提高细胞耐渗透压和底物、产物耐性。从而能有效帮助提高酵母活性、加快酵母耗糖能力、促进发酵进程、降低发酵残糖、提高原料出酒率；更能满足酒精企业节粮降耗、降低综合生产成本和运行费用的需求，这也会给酒精工业的新发展带来非常重要的推动作用。

[1] 贾树彪,李盛贤,吴国峰.新编酒精工艺学[M].北京：化学工业出版社,2009.

[2] 孙建祥.用小麦淀粉生产酒精的工艺探讨[J].酿酒科技,2002(5)：91-93.

[3] 张伟平,赵鑫锐,堵国成,等.酿酒酵母氮代谢物阻遏效应及其对发酵食品安全的影响[J].应用与环境生物学报,2012,18(5)：862-872.

[4] LARGE P J.Degradation of organic nitrogen compounds by yeasts[J].Yeast,1986,2(1)：1-34.

[5] 刘劲松,施清,罗天.应用有机营养优化酒精发酵水平[J].酿酒科技,2016(9)：83-85.

[6] 汪东旭.浅论酒精发酵中酵母菌所需的营养[J].化工技术,2014(10)：46.

[7] 董薇薇,于成.关于酒精发酵中酵母菌所需的营养分析[J].黑龙江科技信息,2014(21)：49.

泸州老窖窖龄酒上半年完成销售近10亿

本刊讯：据《中国酒业新闻》报道，四川泸州老窖窖龄酒类销售股份有限公司2017年7月2日召开2017半年度总结会，会议透露，截止2017年6月20日，窖龄酒公司2017年已完成销售超六成，销售额逼近10亿，复合增长率45%。在品项结构上，转变了以窖龄酒30年为主的产品动销结构，窖龄酒60年销售占比迅速扩大，窖龄酒90年完成包装升级与市场布局。（江源荐，黄筱鹂编辑）

来源：中国酒业新闻 2017-07-04

Influence of Nitrogen Source on S.cerevisiae and Application of Compound Nutrient in Ethanol Fermentation

DONG Kezhi1,CHEN Chunlu1,ZHANG Desheng1,LIU Hui1and SHI Qing2
(1.COFCO Energy(Zhaodong)Co.Ltd.,Suihua,Heilongjiang 152000;2.State Yeast Technology Research&Promotion Center,Yichang,Hubei 443003,China)

In this paper,we summarized the chemical composition of S.cerevisiae and the fermentation raw materials,and the nutritional requirement of S.cerevisiae in ethanol fermentation.Then we analyzed the generating process of ethyl carbamate(EC)with urea as the nitrogen source,and introduced the influence of a compound nutrient on S.cerevisiae and its advantages in practice.(Trans.by HUANG Xiaoli)

S.cerevisiae;ethanol fermentation;fermentation accelerator;compound nutrition;food safety

TS262.3；TS261.4；TS261.3

：A

1001-9286（2017）08-0086-05

10.13746/j.njkj.2017204

2017-07-24

董克芝（1971-），女，黑龙江肇东人，本科，工程师，主要从事酒精生产管理工作。

施清（1987-），男，工程师，主要从事发酵酒精用酵母、营养方面的研究工作，E-mail：shiqing@angelyeast.com。