多重PCR技术用于食源性金黄色葡萄球菌肠毒素的检测

多重PCR技术用于食源性金黄色葡萄球菌肠毒素的检测

金黄色葡萄球菌是造成食物中毒、化脓性疾病的常见菌种，在土壤、空气、水源中均有广泛分布，由于污染食物的概率大，因此成为一项公共卫生问题。就目前而言，已知的肠毒素种类包括19种，由于缺少特异检测手段，尚且不能明确食物中毒的机制。基于此，本文选取145株金黄色葡萄球菌进行研究，探讨了多重PCR检测技术的应用效果。

材料与方法

菌株来源 145株金黄色葡萄球菌从食物检测样本中提取，其中食源性致病菌检测样本110株，包括熟肉、速冻制品、凉拌菜、沙拉、果汁等；食物中毒样本35株，从患者剩余食物、粪便、肛拭子中获得。

仪器试剂 Baird-Parker琼脂培养基、血平板、亚碲酸钾卵黄增菌液，均由北京陆桥技术股份有限公司提供；溶菌酶、基因组提取试剂盒、PCR引物，由上海生工生物工程公司提供；细菌培养箱是由德国宾德公司提供；基因扩增仪、毛细管电泳仪、微量分光光度计等，是由美国IBM公司提供。

方法 菌株复苏:在菌株磁珠冻存管中，用接种环挑取1颗磁珠，放于营养琼脂肉汤中，在37℃温度下培养24小时，并观察其浑浊度。基因提取:取混浊菌液1ml放在1.5ml的EP管内，10000rpm离心3min。除去上层清液，向沉淀物加入200μl溶菌酶溶液（浓度为50mg/ml），混合均匀后，在37℃条件下静置1小时。然后按照DNA提取试剂盒上的说明提取DNA，用微量分光光度计，测定提取DNA的浓度，加纯水直至浓度达到10ng/μl，并保存在-20℃的环境中。引物设计和片段测序:参考GenBank数据库、应用Primer remier分析软件，分别对9种肠毒素基因的PCR引物进行筛选和设计，见下表1。

表1 目的基因的片段长度和引物序列

目的基因片段长度引物序列SEK 273 5’-TTCGTTAGTAGCTGTGACTCCACCA-3’5’-AGTGCCAGCGCTCAAGGTGAT-3’SEL 572 5’-GCTTTCTGGAAGACCGTATCCTGTG-3’5’-ACGGCGATGTAGGTCCAGGAA-3’SEM 268 5’-TCACCTGCTAATGTAACTCCACCGT-3’5’-TCGCAACCGCTGATGTCGGA-3’SEN 524 5’-ACTCTGCTCCCACTGAACCT-3’5’-AACGTGGCAATTAGACGAGTCA-3’SEQ 331 5’-CTCTGCTTGACCAGTTCCGGTGT-3’5’-TGGCGGAATTACGTTGGCGAAT-3’SEU 229 5’-GGCGGTGTGACCGAGCATGA-3’5’-AGCCAGACTCATAAGGCGAACT-3’

单重PCR反应体系:Multiplex PCR Mix2 25μl，上游引物、下游引物均为0.5μl；Multiplex PCR Mix1 0.25μl，模板4μl，加入纯水直至50μl。扩增条件：94℃条件下预热2min，94℃30s、54℃60s、72℃80s，共计35个循环；最后72℃延伸8min。经毛细管电泳处理后，对PCR产物进行测序。多重PCR反应体系:对退火温度、引物浓度等进行调节，优化单重PCR反应体系如下：Multiplex PCR Mix2 25μl，上游引物、下游引物均为0.4μl；Multiplex PCR Mix1 0.25μl，模板4μl，加入纯水直至50μl。扩增条件设置如下：94℃条件下预热2min；然后分别94℃30s、50℃60s、72℃80s，经过35个循环；最后72℃条件下延伸8min。对PCR产物进行毛细管电泳处理，观察结果。

结果

引物特征性验证结果。采用盲筛法，选择9株毛细管电泳结果出现的目的片段菌株，对PCR产物测序后，和GenBank数据库进行比对。结果显示产物片段相似度高，满足研究需求。见表2。

表2 金黄色葡萄球菌肠毒素基因产物测序比对结果

目的基因菌株编号GenBank登录号相似度SEL S-114 NC_003923.1 99% SEM S-005 NC_002758.2 99% SEN S-042 NC_002745.2 99% SEQ S-138 NC_017331.1 99% SEU S-072 NC_009782.1 99%

多重PCR检测结果。利用多重PCR体系，对145株金黄色葡萄球菌的肠毒素基因进行检测，结果显示97株(66.9%)至少含有1种肠毒素基因，48株(33.1%)含有2种及以上肠毒素基因。其中，9种肠毒素基因的检出率从高到低依次为：SEU37株(25.5%)、SEG32株(22.1%)、SEM30株(20.7%)、SEK29株(20.0%)、SEQ26株(17.9%)、SEH23株(15.8%)、SEN15株(10.3%)、SEJ12株(8.3%)、SEL6株(4.1%)。金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌的一种，是造成食物中毒的重要原因之一，美国疾控中心的调查数据显示，该菌株造成的食物中毒占比约为33%，仅次于大肠埃希氏菌，位居第二。对金葡的研究发现，其包含多种致病因子，例如肠毒素、杀白细胞素、溶血素、血浆凝固酶等，其中肠毒素的作用最为明显。肠毒素是低分子蛋白和多肽，具有较强的耐热性，即使在70-80℃条件下，30min以内蛋白不会完全破坏，而且也不会被胰蛋白酶降解。针对已知的肠毒素种类，采用有效的、特异检测手段，能明确食物中毒的发生机制，为临床诊疗提供依据。

本次研究中，以SEG、SHE、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEQ、SEU 9种肠毒素为研究对象，建立了多重PCR检测体系，具有操作简单、通量高、特异性高的优点。结果显示，9种肠毒素均有检出，以SEU、SEG、SEM、SEK的检出率高。另外，相关研究指出，SEK和SEQ之间，SEM和SEN之间，SEG和SEU之间，均存在连锁关系。以SEK和SEQ为例，两者位于同一株金葡菌上，可能会对金葡菌的毒性力度产生影响，有待进一步研究。

综上，多重PCR技术用于食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因检测，准确性和特异性高，具有良好的应用价值。

□ 高利海 精益和泰质量检测股份有限公司