芝麻菜可溶性蛋白提取工艺的研究

徐坤范

（山东省临清市农业局，临清 252600）

芝麻菜可溶性蛋白提取工艺的研究

徐坤范

（山东省临清市农业局，临清 252600）

以芝麻菜为试验材料，对考马斯亮蓝法提取可溶性蛋白的工艺进行了研究。采用单因素试验对影响可溶性蛋白的主要因素提取溶剂及其浓度、料液比和提取时间进行初步研究，然后进行正交试验，再采用方差分析验证正交实验确定的提取工艺，并进行优化。结果表明：NaCl溶液为最佳的提取溶剂；芝麻菜可溶性蛋白提取的最佳条件为0.15 mol/L NaCl溶液、料液比1∶20、提取时间15 min，平均提取量为15.43 mg/g；3个因素对芝麻菜可溶性蛋白提取的影响程度大小先后顺序为：NaCl溶液浓度＞料液比＞提取时间。

芝麻菜 可溶性蛋白 考马斯亮蓝法

芝麻菜（Eruca sativa Mill），又称火箭生菜、紫花南芥等，是十字花科芝麻菜属，一年生草本植物，原产欧洲南部，我国西北、华北、华东等地均有野生种，或作油料作物栽培，因叶片含有芝麻香味，故称芝麻菜[1]。芝麻菜含有丰富的营养物质，如维生素、铁、钙、锌、硒和粗蛋白质，味道鲜美，清香可口，深受消费者青睐[1]；经常食用可以提高免疫力和肝脏解毒的功能，而且还可以降低血液中胆固醇含量，防止或减缓动脉粥样硬化的进程[1]；并具有保健作用，如具有较强的防癌作用，能促进细胞活性，对久咳有特效，还可治疗尿频[2]。因此芝麻菜极具开发价值，而且能填补淡季蔬菜品种[3]。

芝麻菜中蛋白质含量是影响其营养品质、风味品质的重要因素之一。果蔬可溶性蛋白测定方法较多，有Folin—酚试剂（Lowry）法、双缩脲法、微量凯式定氮法等，但是这些方法都存在很多的不足，如Folin—酚试剂法操作繁琐，费时，干扰物质多，专一性差，误差较大[4，5]；双缩脲法虽较快速、蛋白质特异性影响小，但是灵敏度差，所需样品量大，准确度较差[4]；微量凯氏定氮法虽然准确度高、具有普遍性，但是操作繁琐[4]；考马斯亮蓝（Bradford）法以反应快速、操作简便、灵敏度高、干扰物质较少，而且稳定性好[6]等优点，被广泛地应

用在苹果[7]、猕猴桃[8]、小米[9]等多种植物组织可溶性蛋白测定和酶比活力[10]的测定。该文以芝麻菜为实验材料，首先对影响蛋白质提取的因素（提取溶剂、提取溶剂的浓度、料液比和提取时间）进行了单因素测定试验，然后综合单因素试验进行正交优化试验，再采用方差分析验证正交实验确定的提取工艺，并进行优化。确定可溶性蛋白提取的最佳条件，以期为其它蔬菜可溶性蛋白提取条件提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料的制备

于2016年3月20日将白花芝麻菜播种于拱圆大棚中，待芝麻菜生长到30 d，5片真叶时达到商品成熟度，随机取芝麻菜叶片洗净（待水滴干）。称取芝麻菜鲜样1.00 g，放入研钵中加入2 ml提取溶剂研磨成匀浆，转移到离心管中，再用8 ml提取溶剂分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5～1 h以充分提取，然后放入离心机3 000r/min 离心10 min，即得待测样品提取液，上清液备用，重复3次[7]。

1.2 方法

1.2.1 考马斯亮蓝G-250溶液和牛血清白蛋白标准溶液的配制方法

参考邓丽莉[7]等的研究方法。

1.2.2 标准曲线的绘制

取6支试管，在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液（100μg/ml）0.0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，加蒸馏水至1 ml，分别配制成浓度为0、20、40、60、80、100 μg/ ml的蛋白质标准溶液。然后在各支试管中分别加入5 ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，在室温下静置反应5 min左右。在595 nm波长处比色测定吸光度。以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[6，11～13]。

1.3 试验设计

1.3.1 不同提取溶剂对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

精确称取芝麻菜鲜样1.00 g，在45 ℃，料液比为1∶10，提取时间为45 min条件下，考察不同提取溶剂对测定芝麻菜可溶性蛋白含量的影响，分别加10 ml蒸馏水（pH=7）、NaOH溶液（pH=12.56）、NaCl（pH=6.71）溶液和醋酸（pH=3）溶液（0.1 mol/L），3 000r/min离心10 min，各重复3次，采用考马斯亮蓝G-250染色法测定芝麻菜中可溶性蛋白含量，以确定最佳提取溶剂。

1.3.2 不同浓度的提取溶剂对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

图1 标准曲线图

以1.3.1确定的提取溶剂为基准，控制其他因素不变，考察该提取溶剂溶液浓度对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响，精确称取芝麻菜鲜样，共计5份，每份1.00 g，分别加入10 ml（0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.25 mol/L）的该提取溶剂溶液，各重复3次，确定提取溶剂的最佳浓度，其它操作同上。

1.3.3 不同料液比对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

以1.3.1和1.3.2确定的提取溶剂及其浓度为基准，分别精确称取芝麻菜白花品种鲜样1.00 g，控制其他因素不变，对不同料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25进行试验，各重复3次，确定最佳的料液比。

1.3.4 不同提取时间对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

以上述确定的提取溶剂及其浓度和料液比为基准，考察不同时间对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响，精确称取芝麻菜鲜样，共计5份，每份1.00 g，分别放置15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，各重复3次，确定最佳的提取时间。

1.3.5 正交试验

图2 提取溶剂对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

在单因素实验的基础上，采用3因素3水平正交试验，因素水平表见表1。根据确定的提取条件，重复3次实验，进行验证。在以上单因素试验的基础上，以NaCl盐溶液浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）为考察因素，确定每个因素的3个水平，根据L9（34）正交表设计试验，并计算可溶性蛋白提取量，以可溶性蛋白含量为评价指标优选工艺。

图3 不同浓度的NaCl盐溶液对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

图4 不同料液比条件对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

图5 不同提取时间对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

1.4 数据处理与结果计算

采用 Excel 2 010统计分析所有数据并作图，利用DPS9.5软件对差异显著性进行分析。

样品中蛋白质的含量（mg/g）=C*VT（/V1*FW） *1 000[13]

C：查标准曲线值（μg）；VT：提取液总体积（ml）；FW：样品鲜重（g）；V1：测定时加样量（ml）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

考马斯亮蓝提取可溶性蛋白时，R在0.99～1是可接受的[21]。由图1可知，考马斯亮蓝提取可溶性蛋白时R2（相关系数）=0.997 6，说明线性关系较好，此法提取芝麻菜可溶性蛋白质是可行的。

2.2 不同溶剂对可溶性蛋白提取量的影响

由图2可知，提取溶剂对测定芝麻菜中可溶性蛋白含量有着显著的影响，随着提取溶剂pH值的增加，可溶性蛋白提取量呈现先增加后降低的趋势，当提取溶剂为NaCl（pH为6.71）时可溶性蛋白提取量最大，显著大于提取溶剂的提取量；提取溶剂为NaOH（pH为12.56）时提取量最低；因此确定以NaCl溶液为提取溶剂。

2.3 可溶性蛋白提取量的单因素试验

2.3.1 不同浓度的NaCl溶液对可溶性蛋白提取量的影响

由图3可以看出，芝麻菜可溶性蛋白提取量随NaCl溶液浓度的增加呈先上升后下降的趋势，当盐溶液浓度为0.15 mol/L时，可溶性蛋白的提取量最大，显著高于其他各浓度处理，可溶性蛋白提取量为13.32 mg/g；当NaCl溶液浓度＞0.15 mol/L时，再增加盐溶液的浓度，提取量反而降低，这可能是由于随着NaCl溶液浓度的增加，芝麻菜中其它的杂质也被更多地提取出来，使提取液中杂质含量增加，有效成分含量反而降低。因此试验选择0.15 mol/L作为盐溶液浓度筛选其他因素。

2.3.2 不同料液比对测定可溶性蛋白提取量的影响

由图4可知，可溶性蛋白提取量开始时随着料液比的增大而增大，料液比在1∶20时提取量最大为14.52 mg/g；随溶剂用量的增加，提取出的蛋白质反而减小。考虑到料液比的大小会影响后续过滤操作以及溶剂回收过程的难易，故试验选择料液比为1∶15～1∶25较为合适。

2.3.3 不同提取时间对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响

由图5可知，提取时间对芝麻菜可溶性蛋白提取量的影响与NaCl浓度和料液比对可溶性蛋白提取量的影响一致，即随着提取时间的增加提取量先升高后降低，提取时间30 min时提取量最高，显著高于其他各时间处理，芝麻菜可溶性蛋白提取量为13.20 mg/ g，随后再延长提取时间，提取出的可溶性蛋白反而减小，尤其当提取时间延长到75 min时提取量迅速降低，可溶性蛋白为11.40 mg/g，可溶性蛋白提取量迅速降低的原因可能是放置的时间过长，有些蛋白质可能发生了变质现象，且考虑到提取时间的延长会影响试验的操作，因此试验提取时间选择为30 min左右较为合适。

表1 正交试验结果

表2 方差分析

2.4 芝麻菜可溶性蛋白提取条件的正交试验

根据芝麻菜可溶性蛋白提取的单因素实验的结果，选取NaCl浓度、料液比及提取时间进行3因素3水平正交试验。

由表1可知，芝麻菜可溶性蛋白提取的最佳组合为A2B2C3，即最佳提取条件为NaCl溶液浓度为0.15 mol/L、料液比为1∶20、提取时间为45 min；由R值可知，三个单因素对芝麻菜可溶性蛋白提取的影响程度大小先后顺序为：A（NaCl溶液浓度）＞ B（料液比）＞C（提取时间）。

通过方差分析，因为A（NaCl溶液浓度）和 B（料液比）的F值＞均大于 F0.05（2，2）=19.00，是显著因子，对A（NaCl溶液浓度）和 B（料液比）的选择应选最好的水平A2和B2，即（NaCl溶液浓度为0.15 mol/L，料液比为1∶20，因为C因子提取时间不是显著因子，可以任选，从节约时间角度可选择C1（15 min）；方差分析结果NaCl溶液浓度的F值大于料液比的F值，提取时间的F值最小，这与极差R分析结果一致。

称取芝麻菜样品3份，每份1.00 g，按优选工艺条件A2B2C1进行重复验证试验，测定结果分别为15.49 mg/g、15.22 mg/g、15.58 mg/g，平均提取量为15.43 mg/g，表明可溶性蛋白提取的工艺条件较好，说明此工艺稳定可行。

3 结论与讨论

在不同提取剂中，以NaCl盐溶液提取，芝麻菜可溶性蛋白提取量最高；芝麻菜中可溶性蛋白提取的最佳工艺条件为0.15 mol/L NaCl溶液、料液比为1∶20、提取时间为15 min，可溶性蛋白的平均提取率为15.43 mg/g，芝麻菜中蛋白质平均含量为2.48%[1]，因此芝麻菜可溶性蛋白的提取率为62.22%；由R值和F值可知，3个单因素对芝麻菜可溶性蛋白提取的影响程度大小先后顺序为：NaCl溶液浓度＞料液比＞提取时间；实验结果表明该提取工艺简单、稳定、可行，为芝麻菜进一步开发利用提供了科学的理论基础。

[1] 寇凤仙，樊新华，齐巧丽．芝麻菜的开发利用及栽培技术．河北农业科技，2002，（8）：14

[2] 杨银娟，王伟群，施颖红，等．珍稀蔬菜—芝麻菜的栽培技术及营养价值．上海蔬菜．2011，（3）：76～77

[3] 林蒲田．保健新蔬—芝麻菜．湖南农业，2008，（3）：14

[4] 蒋立科，罗曼．生物化学实验设计与实践．北京：高等教育出版社，2007．10

[5] 何幼鸾，汤文浩．物化学实验．武汉：华中师范大学出版社，2006．8

[6] BRADFORD M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding．Analytical Biochemistry，1976，72（1/2）：248～254

[7] 邓丽莉，潘晓倩，生吉萍，等．考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量的条件优化．食品科学，2012，33（24）：185～189

[8] 李淼，檀根甲，李瑶，等．猕猴桃品种酚类物质及可溶性蛋白含量与抗溃疡病的关系．植物保护，2009，35（1）：37～41

[9] 刘剑利，曹向宇，李其久．小米蛋白提取方法比较研究．食品工业，2009，（3）：30～31

[10] BERÜUTER J. Carbohydrate metabolism in two apple genotypes that differ in malate accumulation. Journal of Plant Physiology，2004，161（9）：1011～1029

[11] 吕巧枝，木泰华，孙艳丽.甘薯叶可溶性蛋白提取工艺研究.食品研究与开发，2007，28（03）：18～21

[12] A.Ghazi，S.Metwali etal.Protein isolates from Egypeian sweet potato leaves.Die Nahrung，1982，33（2）：145～151

[13] 李雪雁，张维，张秀兰，等.菊芋可溶性蛋白的提取及其分子质量的测定.食品与发酵工业，2010，136（13）：184～186

[14] 王福荣.生物工程分析与检验.北京：中国轻工业出版社，2005，140～148.