人肝肿瘤细胞SMMC- 7721、HepG2对去甲斑蝥素- 半乳糖修饰壳聚糖纳米粒的摄入及S180荷瘤小鼠在体抗肿瘤活性的影响

徐晓莉 李晓森 王 钦 王 静

(南通大学附属医院药学部，江苏 南通 226001)

人肝肿瘤细胞SMMC- 7721、HepG2对去甲斑蝥素- 半乳糖修饰壳聚糖纳米粒的摄入及S180荷瘤小鼠在体抗肿瘤活性的影响

徐晓莉 李晓森1王 钦 王 静

(南通大学附属医院药学部，江苏 南通 226001)

目的 了解人肝肿瘤细胞SMMC- 7721、HepG2对去甲斑蝥素(NCTD)- 半乳糖修饰壳聚糖纳米粒(NCTD- GC- NPs)的摄入及S180荷瘤小鼠在体抗肿瘤活性。方法 以FITC标记NCTD- GC- NPs为实验组，培养基为空白组，FITC标记去甲斑蝥素壳聚糖纳米粒(NCTD- CS- NPs)为对照组，采用流式细胞仪测定培养1、3、5、9、16、24 h时SMMC- 7721、HepG2细胞对6 μg/ml纳米粒的摄入程度及培养5 h时SMMC- 7721、HepG2细胞对1、3、6、12、24 μg/ml纳米粒的摄入程度。S180荷瘤小鼠被随机分为8组(n=10)，生理盐水组，NCTD组，高、中、低剂量NCTD- CS- NPs组(对照组)、高、中、低剂量NCTD- GC- NPs组(实验组)，腹腔注射10 d后剥离肿瘤，计算抑瘤率、胸腺指数、脾指数。结果 SMMC- 7721、HepG2细胞对NCTD- CS- NPs、NCTD- GC- NPs的摄入均有时间依赖性，NCTD- GC- NPs的平均荧光强度显著高于NCTD- CS- NPs(P均<0.05)。SMMC- 7721、HepG2细胞对不同浓度NCTD- CS- NPs摄入平均荧光强度显著低于NCTD- GC- NPs(P均<0.05)。SMMC- 7721细胞可不同程度地摄入荧光标记后的NCTD- CS- NPs与NCTD- GC- NPs，但对NCTD- GC- NPs的摄入量更大。各给药组的S180荷瘤小鼠的瘤重均低于生理盐水组(P均<0.05)；随着NCTD浓度上升，对照组、实验组的抑瘤率也随之提高；各给药组的脾指数与生理盐水组比较均无统计学差异(P均>0.05)；低剂量对照组及实验组的胸腺指数高于生理盐水组(P均<0.05)，而中、高剂量对照组及实验组的胸腺指数与生理盐水组比较均无统计学差异(P均>0.05)。结论 NCTD- GC- NPs可发挥双重肝靶向作用，显著提高药物的抗肿瘤作用，且无明显免疫抑制作用。

去甲斑蝥素；半乳糖修饰壳聚糖；肝靶向纳米粒；细胞摄入；在体抗肿瘤活性

原发性肝癌多发病于老年人群，化疗是其主要的治疗手段，在传统中药中发现抗肿瘤活性成分并制备成新型靶向抗肝肿瘤制剂已经成为近年来的研究热点。去甲斑蝥素(NCTD)是传统中药斑蝥主要药用成分斑蝥素的衍生物，能调节免疫功能、保护肝细胞，其片剂主要用于治疗原发性肝癌，其明显的优点在于不会导致患者白细胞降低，反而具有一定的升高白细胞的作用〔1，2〕。但是在临床应用的过程中，NCTD表现出一定的泌尿道毒性，也可能会发生头晕、呕吐等全身性症状，这种毒副作用是由于片剂的靶向性不高造成的。因此，研发NCTD的新型靶向制剂有利于降低由于药物选择性低引起的不良反应。壳聚糖是一种取自动物甲壳的可再生材料，目前已广泛应用在食品、医药、农业、造纸业、化妆品等领域〔3，4〕，特别是在用于生物医学材料方面受到广大医药研究者的重视，其应用前景十分广阔。由于壳聚糖无毒无害、生物相容性良好、可生物降解，有抑菌、抗酸、促进伤口愈合、降血脂、抗肿瘤等用，常作为新型药物辅料制备各种新制剂。壳聚糖作为一种高分子材料，含有丰富的氨基基团，其化学性质活泼，因而可在氨基的N位发生交联反应，得到的壳聚糖N位衍生物可作为新型药物载体〔5～7〕。纳米粒是一种常见的被动靶向制剂，由于其粒径很小，可被肝脏中的网状内皮细胞直接吞噬，纳米粒则能被动地靶向分布在肝组织内，更好地发挥肝脏治疗药物的效果〔8〕。此外，肝细胞中含有去唾液酸糖蛋白受体，它是主动肝靶向制剂的作用靶点。去唾液酸糖蛋白受体能特异性识别β- D- 半乳糖，因此制备半乳糖修饰壳聚糖(GC)可为作为去唾液酸糖蛋白受体的配体〔9〕，而将GC制备成的纳米粒将具有双重肝靶向特性。本研究制备去甲斑蝥素- 半乳糖修饰壳聚糖纳米粒(NCTD- GC- NPs)，观察人肝肿瘤细胞SMMC- 7721、HepG2对NCTD- GC- NPs的摄入情况及S180荷瘤小鼠在体抗肿瘤活性。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器 人肝肿瘤细胞SMMC- 7721、HepG2，鼠源性S180肿瘤细胞(苏州大学医学部药学院提供)。培养基：含10%小牛血清的RPMI- 1640；培养环境：37℃，5%CO2。清洁级昆明种小鼠80只，体质量(20±2)g，雌雄各半，苏州大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(苏)2012- 0045。NCTD(山东信宜制药有限公司，批号20150411)；壳聚糖(江苏南通兴成生物制品厂，脱乙酰度93.1%，分子量8～10 kD)；小牛血清(超级纯，西诺生物科技有限公司)；RPMI- 1640培养基(美国Gibco公司)；异硫氰酸荧光素(FITC)(美国Sigma公司)；1∶250胰蛋白酶(上海沃凯化学试剂有限公司)。GC：自行合成，在30℃温度下，壳聚糖与乳糖酸、1- (3- 二甲氨基丙基)- 3- 乙基碳二亚胺(EDC)、N- 羟基丁二酰亚胺(HOSu)发生缩合反应获得GC，乳糖酰基取代度为8.92 %。HERAcell型二氧化碳细胞培养箱、FC型酶联免疫监测仪(美国Thermo公司)；Optima XE型超速冷冻离心机(美国Beckman公司)；CytoFLEX型流式细胞分析仪(美国Beckman Coulter公司)；ML11型生物显微镜、IX71- F22FL/PH型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 NCTD- GC- NPs的制备方法 将100 mg GC和20 mg NCTD先后溶解于50 ml 0.2 %醋酸水溶液中，在500 r/min磁力搅拌下，保持30℃恒温水浴，滴入1.5 mg/ml三聚磷酸钠溶液，当溶液产生乳光时停止滴入，过0.45 μm微孔滤膜，-50℃冷冻干燥后即得。在电子显微镜下观察制备的NCTD- GC- NPs，结果纳米粒形态圆整，分散良好，无粘连，粒径分布均匀。采用激光衍射法测得纳米粒的粒径为(118.7±8.84)nm；采用HPLC法测得载药量为(10.38±0.06)%，包封率为(57.92±0.40)%(n=5)。

1.3 FITC标记NCTD- GC- NPs的制备方法 将1.0 g GC溶解于0.1 mol/L乙酸溶液，逐滴滴加30 ml FITC- 甲醇溶液，避光搅拌4 h，然后加入0.2 mol/L NaOH溶液将产物沉淀。将沉淀在3 000 r/min转速下离心15 min，采用甲醇水溶液(V∶V=70∶30)重复洗涤离心数次，当上清液在485 nm、535 nm波长下无荧光检出时为止。再用甲醇洗涤离心3次，充分脱水，避光-50℃冷冻干燥，即得FITC标记GC。采用1.2方法，避光条件下采用FITC标记GC制备得到FITC标记NCTD- GC- NPs。

1.4 SMMC- 7721、HepG2细胞的摄入 无菌操作分离对数生长期SMMC- 7721与HepG2细胞，加入6孔细胞培养板内，每孔细胞计数1×105个。以FITC标记NCTD- GC- NPs为实验组，培养基为空白组，FITC标记NCTD- CS- NPs为对照组。然后将培养板置5%CO2细胞培养箱内在37℃恒温下培养24 h后，采用胰蛋白酶消化，并用PBS洗涤离心3次，采用流式细胞仪收集1×104个肿瘤细胞，测定平均荧光强度。分别观察培养1、3、5、9、16、24 h时细胞对6 μg/ml纳米粒的摄入程度及培养5 h时细胞对1、3、6、12、24 μg/ml纳米粒的摄入程度。

1.5 纳米粒在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤活性 取对数生长期的S180肿瘤细胞，采用RPMI- 1640培养液稀释细胞浓度为1×107个/ml，抽取0.2 ml对小鼠进行腹腔注射。室温常规饲养7 d后，处死腹水瘤小鼠，取2 ml腹水，采用适量0.9%氯化钠注射液稀释，在1 500 r/min转速下离心10 min，取上清液，进一步稀释细胞浓度为1×107个/ml。抽取上述腹水瘤细胞悬浮液在小鼠右腋皮下部位接种0.2 ml，室温下常规饲养。将荷瘤小鼠随机分为8组(n=10)，生理盐水组为空白对照，NCTD组(2.0 mg/kg NCTD)为原料药对照，NCTD- CS- NPs组(对照组)、NCTD- GC- NPs组(实验组)均有高(4.0 mg/kg NCTD)、中(2.0 mg/kg NCTD)、低(0.5 mg/kg NCTD)剂量。分别腹腔注射给予生理盐水、NCTD、NCTD- CS- NPs和NCTD- GC- NPs，每日1次，连续给药10 d。10 d后处死并剥离完整的肿瘤，称瘤重，并取出完整的脾脏、胸腺，分别称重。计算抑瘤率、胸腺指数及脾指数。

1.6 统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件进行t检验。

2 结 果

2.1 不同培养时间的细胞摄入试验 采用流式细胞仪测试SMMC- 7721与HepG2细胞的荧光强度。在5 h内SMMC- 7721、HepG2细胞对NCTD- CS- NPs的摄入呈线性上升趋势，在16 h后达到饱和；而SMMC- 7721、HepG2细胞对对照组的摄入也有时间依赖性，但平均荧光强度显著低于实验组(P均<0.05)。见表1。

2.2 不同浓度纳米粒的摄入试验 SMMC- 7721、HepG2细胞对低浓度NCTD- GC- NPs的摄入较好，但对高浓度NCTD- GC- NPs的摄入有饱和趋势；而SMMC- 7721、HepG2细胞对不同浓度对照组摄入平均荧光强度显著低于实验组(P均<0.05)。见表2。

表1 不同培养时间细胞对6 μg/ml纳米粒的摄入情况

与对照组比较：1)P<0.05，下表同

表2 培养5 h时细胞对不同浓度纳米粒的摄入情况

2.3 S180荷瘤小鼠在体抗肿瘤活性 各给药组的瘤重均显著低于生理盐水组(P均<0.05)。随着NCTD浓度上升，各组抑瘤率也随之提高，其中低、中、高剂量对照组抑瘤率分别22.21%、29.47%、53.98%，低、中、高剂量实验组抑瘤率分别为23.64%、44.33%和60.81%，高剂量对照组及中、高剂量实验组抑瘤率明显大于NCTD组(30.15%，均P<0.05)；各给药组的脾指数与生理盐水组的差异均无统计学意义(P均>0.05)；NCTD组和低剂量对照组及实验组的胸腺指数显著高于生理盐水组(P均<0.05)；而中、高剂量对照组及实验组的胸腺指数与生理盐水组无显著差异(P均>0.05)。见表3。

表3 S180荷瘤小鼠的瘤重与免疫指数

与生理盐水组比较：1)P<0.05；与NCTD组比较：2)P<0.05

3 讨 论

NCTD的分子结构决定其不易进行荧光标记，且国内外均无相关报道，另外，即使NCTD能够被荧光标记，因为其分子量较小，经过荧光标记后其化学结构与分子量变化太大必会对试验结果产生较大的影响。壳聚糖含有丰富的游离氨基，与FITC反应较为容易，且壳聚糖为高分子化合物，经荧光标记后分子量不会发生明显改变，因而对试验结果几乎无影响〔10，11〕。GC作为壳聚糖的衍生物，也含丰富的游离氨基，因此也可进行FITC荧光标记考察纳米粒的肝靶向性。

人肝肿瘤细胞中含有去唾液酸糖蛋白受体，可作为主动肝靶向制剂的作用靶点，GC分子结构中含半乳糖基团，可被肝肿瘤细胞中的去唾液酸糖蛋白受体识别，并能与之特异性结合〔12，13〕。人肝肿瘤SMMC- 7721、HepG2细胞均具有去唾液酸糖蛋白受体，且均为实验室常用的人源性肝肿瘤细胞模型，所以本研究采用SMMC- 7721、HepG2细胞作为体外肝肿瘤模型。

壳聚糖具有一定的抗肿瘤作用，有文献报道100 mg·kg-1·d-1壳聚糖溶液静脉注射入荷瘤小鼠体内后，壳聚糖能表现出显著地抑制肿瘤细胞生长的作用〔14〕。此外，张澄波等〔15〕将壳聚糖溶液腹腔注射入腹水瘤小鼠体内，结果表明剂量在30 mg/kg时观察不到抗肿瘤作用，而剂量在100 mg/kg时腹水生成时间延长，剂量在200 mg/kg时对腹水瘤的抑制作用明显，其结论为壳聚糖并不能直接杀灭肿瘤细胞，但可增强非特异性免疫功能间接发挥抑制肿瘤生长的作用。因此，壳聚糖在较高剂量时才会体现出一定的抑制肿瘤生长的作用，且壳聚糖载体只适合于肿瘤的预防及辅助治疗。本研究中纳米粒的最高剂量组的壳聚糖或GC的剂量才相当于35 mg/kg，此时壳聚糖并不会表现出明显的抑制肿瘤生长的作用，所以本研究中并未将空白纳米粒作为纳米粒抗肿瘤活性研究的对照，仅将NCTD原料药作为对照。

本研究结果表明，SMMC- 7721、HepG2细胞对NCTD- GC- NPs摄入率更高，其原因是GC中含有半乳糖基团，可作为配体与SMMC- 7721、HepG2细胞的去唾液酸糖蛋白受体特异性结合，从而NCTD- GC- NPs成为肝主动靶向制剂，加之纳米粒本身具有的被动靶向性，NCTD- GC- NPs具有双重肝靶向性。随着NCTD浓度的升高，两种纳米粒对S180荷瘤小鼠的抑瘤率均明显增加，这表明NCTD的在体抑瘤率具有浓度依赖性，制备成纳米粒后，两种纳米粒均能提高NCTD对S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制程度，NCTD- GC- NPs则能进一步提高NCTD对S180实体瘤的抑制程度。这是由于NCTD- GC- NPs在S180荷瘤小鼠体内能增强NCTD在肝组织中的分布程度，与肝肿瘤细胞的亲和性更好。两种纳米粒与NCTD均未表现出明显的脾脏免疫抑制，大部分纳米粒组的胸腺指数与生理盐水对的无明显差异，然而两种低剂量纳米粒能提高胸腺指数，高剂量纳米粒的胸腺指数无明显差异。这是由于NCTD具有免疫调节作用，并能升高白细胞水平，而这种作用可能与促进胸腺免疫功能有关〔16〕。

综上，本研究制备的NCTD- GC- NPs在体外对肝肿瘤SMMC- 7721和HepG2细胞均有良好的亲和性，在S180荷瘤小鼠体内发挥良好的抗肝肿瘤作用，并能有效增强NCTD的抗肝肿瘤作用，作为一种新型双重肝靶向抗肝肿瘤制剂具有良好的应用前景。

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〔2016- 03- 17修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

南通市科技计划项目(MS22016055)

王 钦(1985- )，男，硕士，主管药师，主要从事药物基因组学研究。

徐晓莉(1970- )，女，主管药师，主要从事中药药理学研究。

R285

A

1005- 9202(2017)15- 3661- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.009

1 吉林大学第一医院肿瘤妇科