聚醚醚酮/碳纳米管/生物活性玻璃复合材料的成骨细胞相容性研究

郑延延，刘吕花，韩崇涛，熊成东，张丽芳

(1.川北医学院基础医学院，四川 南充 637000； 2.中国科学院成都有机化学研究所，四川 成都 610041)

聚醚醚酮/碳纳米管/生物活性玻璃复合材料的成骨细胞相容性研究

郑延延1，刘吕花1，韩崇涛2，熊成东2，张丽芳2

(1.川北医学院基础医学院，四川 南充 637000； 2.中国科学院成都有机化学研究所，四川 成都 610041)

目的：探讨新型聚醚醚酮/碳纳米管/生物活性玻璃(PEEK/CNTs/BGs)复合材料的体外成骨细胞相容性。方法：体外培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1，通过噻唑蓝法、吖啶橙荧光染色法研究PEEK/CNTs/BGs复合材料对成骨细胞增殖的影响。应用扫描电镜(SEM)观察MC3T3-E1细胞在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面的黏附生长情况。结果：MC3T3-E1细胞在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面的增殖能力较聚醚醚酮和聚醚醚酮/碳纳米管(PEEK/CNTs)复合材料强。SEM实验结果表明，PEEK/CNTs/BGs复合材料表面有利于MC3T3-E1细胞黏附、铺展和生长。结论：PEEK/CNTs/BGs复合材料具有良好的成骨细胞相容性，有望作为新型骨科材料。

聚醚醚酮；碳纳米管；生物活性玻璃；成骨细胞相容性；骨科材料

传统骨科金属材料的弹性模量，如钛(100 GPa)及钛合金(105—125 GPa)，比人皮质骨(6—23 GPa)高数倍[1-2]。这种不匹配的弹性模量会引起“应力屏蔽”效应，造成植入体周围发生骨吸收和骨萎缩，最终植入失败。此外，金属材料可能释放出金属离子使周围组织发生炎症，且在常用的医学影像技术(CT、MRI等)下金属材料会产生伪影，不利于骨生长和愈合的有效监控。因此，研发性能更加优良的新型骨科材料是非常必要的。

热塑性特种工程塑料聚醚醚酮(PEEK)由于其弹性模量和人皮质骨较为接近，具有良好的生物相容性、X射线透过性、CT或MRI成像下无伪影等优点[2-4]，受到材料学和骨科学研究者越来越高的重视，期望其能替代传统医用金属材料用作骨科材料。但PEEK本身是生物惰性材料，植入体内后，不能和骨组织发生牢固的骨整合。生物活性玻璃(BGs)具有良好的生物活性，能和骨组织形成牢固的骨整合，但BGs脆性大、韧性差[5]，将其添加到PEEK中使PEEK获得生物活性的同时却降低其优异的力学性能，使之不能满足用作承力骨的性能要求[2,7]。碳纳米管(CNTs)具有优异的力学性能、良好的韧性以及纳米特性[6]，PEEK/BGs复合材料中掺杂CNTs可获得力学性能优异的PEEK/CNTs/BGs复合材料[7]。目前该复合材料的成骨细胞相容性未见文献报道。本研究将PEEK/CNTs/BGs复合材料与小鼠成骨细胞MC3T3-E1共培养，通过噻唑蓝法、吖啶橙荧光染色法研究PEEK/CNTs/BGs复合材料对成骨细胞增殖的影响。应用扫描电镜(SEM)观察MC3T3-E1细胞在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面的黏附生长情况。初步评价PEEK/CNTs/BGs复合材料的体外成骨细胞相容性，为该材料下一步体内实验评价及临床应用提供科学依据。

1 材料及方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 试剂 PEEK/CNTs复合材料(实验室自制，CNTs的重量分数为6%)；PEEK/CNTs/BGs复合材料(实验室自制，CNTs和BGs的重量分数分别为6%和4%)；小鼠成骨细胞MC3T3-E1(四川大学华西口腔疾病国家重点实验室提供)；DMEM培养基(Hyclone公司)；小牛血清(成都奥克生物技术有限公司)；吖啶橙(北京化学试剂有限公司)；噻唑蓝(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，MTT，Sigma公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；链霉素、青霉素(成都艾科达试剂有限公司)；磷酸盐缓冲剂(PBS，Hyclone公司)；二甲基亚砜(DMSO)、戊二醛、无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)。

1.1.2 仪器 荧光显微镜(X60，Olympus公司)；扫描电镜(S-4200，Hitachi公司)；酶标仪(Varioskan Flash 3001，Thermo 公司)。

1.2 细胞培养

采用小鼠成骨细胞MC3T3-E1进行实验，利用含10%小牛血清及双抗的DMEM培养基对细胞进行培养，培养液每2 d更换1次。细胞长至约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代培养以获得大量细胞供后续实验。所有的培养均在37 ℃、5% CO2以及饱和湿度的培养箱中进行。

1.3 噻唑蓝细胞增殖实验

噻唑蓝(MTT)法是目前检测细胞增殖较为常用且简单有效的方法[8-9]。将PEEK、PEEK/CNTs、PEEK/CNTs/BGs复合材料经环氧乙烷灭菌后，置于96孔细胞培养板中，以1×104个/孔的数量接种细胞，每孔加入培养基200 μL，在37 ℃、5% CO2的培养箱中分别培养1、3和6 d。每个样品设置3个平行样，空白对照组为不含样品的组织培养孔(TCPS)，每2 d更换1次培养基。在相应的时间点弃去原有培养基，用灭菌的PBS缓冲液冲洗2次后，重新加入200 μL新鲜培养基，然后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，放入孵箱培养3.5 h。轻轻吸去上层液体，每孔加入200 μL DMSO，在摇床上震荡0.5 h，吸取100 μL溶解液转入新的96孔板中，利用酶标仪测定490 nm处的光学密度值。

1.4 吖啶橙荧光染色实验

将经环氧乙烷灭菌的PEEK、PEEK/CNTs、PEEK/CNTs/BGs复合材料置于96孔细胞培养板中，以2×104个/孔的数量接种细胞，每孔加入培养基200 μL，在37 ℃、5% CO2的培养箱中分别培养1、3和6 d。在相应的时间点弃去原有培养基，用灭菌的PBS缓冲液冲洗2次，接着用0.1 mg/mL的吖啶橙溶液避光染色20 min，取出样品再次用PBS缓冲液冲洗2次，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 扫描电镜实验

将经环氧乙烷灭菌的PEEK/CNTs/BGs复合材料置于96孔细胞培养板中，以2×104个/孔的数量接种细胞，每孔加入培养基200 μL，在37 ℃、5% CO2的培养箱中分别培养1、2和3 d。在相应的时间点弃去原有培养基，灭菌的PBS缓冲液冲洗2次后，用4%戊二醛4 ℃固定2 h，再利用30%、50%、75%、85%、95%、100%的乙醇系列溶液脱水，每次15 min。待样品干燥后，试样表面喷金并用SEM观察材料表面的细胞形态。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 噻唑蓝法检测成骨细胞在材料表面的增殖活性

图1为小鼠成骨细胞MC3T3-E1在材料表面的MTT增殖检测结果。由图可以看出，随培养时间的增加，各组材料的光学密度值均有一定程度的增加，表明细胞能在材料表面正常增殖生长，材料无毒性。此外，还可以看出，随培养时间的增加，尤其是培养到第6天，PEEK/CNTs/BGs复合材料的光学密度值明显高于PEEK和PEEK/6%CNTs复合材料(P<0.05)，说明PEEK材料中引入BGs能有效的提高了其表面的成骨细胞增殖活性。

2.2 吖啶橙荧光染色法检测成骨细胞在材料表面的增殖活性

图2、图3和图4为细胞在材料表面培养1、3和6d后的吖啶橙荧光染色结果。从图中可以看出，培养1d后，就有细胞在材料表面黏附，且均匀分布在材料表面；培养 3d后，所有样品组上的细胞数量均明显增加，细胞之间的间隙减少，细胞与细胞开始相互连接起来；培养6d后，细胞几乎长满了材料表面，细胞间的空隙较少，没有发现明显的细胞死亡，说明材料均具有较好的成骨细胞相容性。

对比PEEK和PEEK/CNTs复合材料表面细胞的荧光染色照片(图2与图3)，可以看出细胞第1 天便能黏附在两种材料表面，生长良好并随着时间的推移能正常生长增殖，表明材料没有明显的细胞毒性。但PEEK/CNTs复合材料表面细胞生长情况与PEEK相比，细胞生长密度要小些，可以看出添加碳纳米管对细胞生长稍有影响，但尚未表现出明显的细胞毒性。

对比PEEK/CNTs和PEEK/CNTs/BGs复合材料表面细胞的荧光染色照片(图3与图4)发现，PEEK/CNTs/BGs复合材料表面的细胞繁殖较快，生长情况良好，培养3d后就几乎长满了材料表面，细胞数量较PEEK/CNTs复合材料上的多些，培养6d后，不仅长满了材料表面而且开始向上生长形成多层细胞，而PEEK/CNTs复合材料表面细胞间还存在许多间隙，且只形成单层细胞。由此说明添加BGs促进了成骨细胞在材料表面的黏附与生长。

2.3 扫描电镜观察成骨细胞在材料表面的黏附生长情况

扫面电镜观察成骨细胞MC3T3-E1在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面培养1d和3d后的细胞黏附生长情况，结果如图5和图6所示。从图中可以看出，成骨细胞能较好地黏附在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面且生长形态良好。细胞伸出长短不一的板状伪足或丝状伪足紧密贴附在材料表面，附着在材料表面的细胞呈梭形或不规则形，均属细胞的正常生长形态。随培养时间的延长细胞密度逐渐增多，细胞间相互接触，培养3d时，细胞不仅铺满PEEK/CNTs/BGs复合材料表面，而且开始三维向上生长。图5和图6结果表明PEEK/CNTs/BGs复合材料表面有利于MC3T3-E1细胞黏附、铺展和生长。

3 讨论

PEEK自身的众多优异性能，如弹性模量更接近骨骼、良好的生物相容性、X射线可透过性等，使其有望替代传统医用金属材料，应用到脊柱、关节等领域。PEEK是一种极具潜力的骨科植入材料，但其自身无生物活性，不能与骨组织形成骨整合，使其应用受到一定程度的限制。BGs的主要成分为45wt%SiO2-24.5wt%CaO-24.5wt%Na2O-6wt%P2O5，植入体内后能通过其表面形成的富二氧化硅凝胶层，诱导类骨磷灰石形成，并通过这层类骨磷灰石与骨组织形成牢固的骨整合[5]。但BGs的脆性大、韧性差、生理环境中疲劳和破坏强度不高等弱点，限制了其在承力部位的应用。将BGs添加到PEEK基体中制备复合材料能改善PEEK的生物活性，但研究发现BGs的引入降低了PEEK的力学性能。而将力学性能较优异的CNTs添加到PEEK/BGs复合材料中制备PEEK/CNTs/BGs复合材料可使PEEK获得生物活性的同时维持其优异的力学性能。力学性能测试结果表明当CNTs含量为6%，BGs含量为4%时制备的PEEK/CNTs/BGs复合材料力学性能较优异，同时在模拟体液中能诱导类骨磷灰石形成，表明PEEK/CNTs/BGs复合材料在体内可能具有良好的生物活性[7]。

本实验在此基础之上，将PEEK/CNTs/BGs复合材料与成骨细胞共同培养，进一步研究该复合材料的体外成骨细胞相容性，为该材料下一步体内实验评价及临床应用提供科学依据。MTT能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶的紫色结晶物甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞却没有该功能。甲臜能溶在DMSO中，并在490nm波长处有特定的光学密度值，且光学密度值与活细胞数量成正比。随培养时间推移，PEEK/CNTs/BGs复合材料的光学密度值逐渐增加，且在培养第3天和第6天时均高于PEEK和PEEK/CNTs组，说明PEEK/CNTs/BGs复合材料表面成骨细胞能保持较高的增殖活性。吖啶橙是一种具有高度特异性荧光染料，能透过正常细胞膜使DNA和RNA染色，荧光显微镜下使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。吖啶橙荧光染色结果同样说明成骨细胞在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面具有较高的增殖能力。

接种后的细胞在材料表面的生长形态、与材料的黏附情况是研究细胞与材料相互关系的简单有效的方法，也是评估生物材料细胞相容性的重要指标，细胞在材料上的形态也能较准确地反应出材料对细胞的影响，具有良好生物相容性的材料，不仅细胞增殖正常，无明显的坏死现象，而且细胞生长形态也正常。黏附是贴壁型细胞增殖生长并发挥其生理功能的重要前提，所以细胞首先必须与材料发生适当的黏附才能进行分化和增殖，进而发挥生理功能[10]。SEM观察结果发现成骨细胞MC3T3-E1能在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面黏附生长，伸出板状或丝状伪足，生长形态正常，且随着时间的延长，细胞能铺满材料表面。SEM结果从细胞生长形态上进一步证明了成骨细胞在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面能正常黏附、铺展与生长。

通过噻唑蓝法、吖啶橙荧光染色法及扫面电镜观察，结果显示成骨细胞能在PEEK/CNTs/BGs复合材料表面黏附、铺展、生长，且生长形态良好，预示该复合材料具有良好的体外成骨细胞相容性，有望作为新型骨科材料。

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(学术编辑：肖东琴)

本刊网址：http：//www.nsmc.edu.cn

作者投稿系统：http：//noth.cbpt.cnki.net

邮箱：xuebao@nsmc.edu.cn

Study on osteoblast compatibility of polyetheretherketone/carbon nanotubes/bioactive glasses composite

ZHENG Yan-yan1,LIU Lv-hua1,HAN Chong-tao2,XIONG Cheng-dong2,ZHANG Li-fang2

(1.SchoolofBasicMedicalSciences,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000；2.ChengduInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciences,Chengdu610041,Sichuan,China)

Objective：To explore osteoblast compatibility of polyetheretherketone/carbon nanotubes/bioactive glasses (PEEK/CNTs/BGs) composite in vitro.Methods：PEEK/CNTs/BGs composite was co-cultured with osteoblast MC3T3-E1invitroto evaluate the effects of the composite on osteoblast proliferation by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide (MTT) and acridine orange fluorescent staining method.Meanwhile,the adhesion and growth of MC3T3-E1 cells on PEEK/CNTs/BGs composite surface were observed by scanning electron microscopy (SEM).Results:It was found that MC3T3-E1 cells on PEEK/CNTs/BGs composite surface had better proliferation activity than that on PEEK and polyetheretherketone/carbon nanotubes (PEEK/CNTs) composite surfaces.SEM results showed that PEEK/CNTs/BGs composite surface was conductive to MC3T3-E1 cells adhesion,spreading and growth.Conclusion:PEEK/CNTs/BGs composite has excellent osteoblast compatibility in vitro and might be used as a novel orthopedic material.

Polyetheretherketone;Carbon nanotubes;Bioactive glasses;Osteoblast compatibility;Orthopedic material

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.04.001

中国科学院“西部之光”重点项目；川北医学院博士基金项目(CBY16-QD-02)；川北医学院科研发展计划项目(CBY16-A-ZD02)

2017-04-12

郑延延(1986-)，男，博士，讲师。E-mail：yanyzheng@163.com

张丽芳，E-mail:zhanglfcioc@163.com

时间：2017-8-15 11∶26 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170815.1126.002.html

1005-3697(2017)-04-0484-04

R318.08

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