杜洛克种猪抗腹泻新品系选育研究

熊胜利，龙清孟，陈大芳，甘 霖，谭晓山，李 俊，尹杨莎，李建伟，王 燕，冉雪琴（.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 55008；.贵州大学，贵州 贵阳 55005）

遗传育种

杜洛克种猪抗腹泻新品系选育研究

熊胜利1，龙清孟1，陈大芳1，甘 霖1，谭晓山1，李 俊1，尹杨莎1，李建伟1，王 燕1，冉雪琴2（1.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550018；2.贵州大学，贵州 贵阳 550025）

猪肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是引起断乳前后仔猪腹泻的主要致病菌，试验利用分子检测技术鉴别MUC13基因型，选育具有腹泻抗性基因型群体，在种猪世代选育中培育抗腹泻专门化新品系，从种源上提高新生仔猪及断奶前后仔猪抗腹泻能力，降低新生仔猪及断奶前后仔猪腹泻率，最大限度挖掘并提高猪场断奶仔猪成活率的潜能，提高猪场的经济效益和国外引进种猪的使用价值。试验地点为贵州省种畜禽种质测定中心猪场，试验猪群为贵州省种畜禽种质测定中心2007年从美国引进的杜洛克种猪。2016年，对美系杜洛克种猪父母本按照2种组合进行选配：1）GG♂×GG♀，从9窝不同父母本选配所生的F1代中，每窝选留符合种用要求仔猪1～2头，共11头，采耳组织样作MUC13基因型检测，检测结果显示，11头均为腹泻抗性有利基因GG型个体，腹泻有利基因GG型检出率100%（11/11），进一步将F1代按照GG♂×GG♀选配，从1窝F2代仔猪中选出符合种用要求的5头仔猪作为选留后备猪，抗腹泻基因检测结果5头均为GG型基因个体，说明父母本按照GG♂×GG♀选配方案，其后代可以稳定遗传抗腹泻基因GG型。2）GA♂×GA♀，采用常规选留方法，从1窝杜洛克仔猪中选出符合种用要求的8头作为选留后备猪，抗腹泻基因检测结果8头均为GA型，未检测出GG、AA型个体。

杜洛克；肠毒性大肠杆菌（ETEC）；MUC13基因型；组合选配；抗腹泻新品系

断奶前后仔猪腹泻是养猪业中的一种常见疾病。肠毒素性大肠杆菌（ETEC）F4ac是引发新生仔猪和断奶前后仔猪腹泻的最主要致病菌[1]。研究发现，F4ac型是ETEC（F4）菌毛3种血清型（F4ab型、F4ac型、F4ad型）中致病性最强、流行性最广的一类[2-3]。据报道，在养猪业发达的瑞典、英国和丹麦，新生仔猪腹泻的发生率分别为 75.0%、50.5%和36.6%[3-5]。我国仔猪腹泻的发生率也很高，2012年对国内某省4 118个养猪场户进行的流行病学调查发现，哺乳仔猪腹泻发生率高达18.31%、死亡率在10.44%～57.01%之间不等[6-7]。早年在猪流行性腹泻病毒还没被大量报道之前，我国仔猪腹泻的发生率全年平均高达为46.5%[8]，个别地区甚至更高。近年来更是出现猪流行性腹泻病毒和ETEC混合感染导致仔猪大面积发生腹泻和死亡的事件。

在种猪常规选种选育的基础上，利用基因检测鉴定技术辅助育种，在世代选育中，选留体型外貌和生产性能优秀的个体，逐渐加大纯合抗性个体的选留比例，逐步淘汰杂合、纯合易感基因型个体，提高育种群中有利基因频率，培育具有一定抗性专门化品系的方法在种猪育种生产中得到研究和运用。2012年起，我中心开展了种猪抗腹泻相关基因检测及抗腹泻后代选育研究，对美系杜洛克种猪父母本按照2种组合进行选配，即GG♂×GG♀、GG♂×GA♀，在相同的饲养环境条件下，跟踪观察其哺乳仔猪腹泻发生率、腹泻致死率、其他原因致死率、断奶成活率，结果表明，这2种组合选配所生仔猪在哺乳期（27 d断奶）的腹泻发生率分别为2.97%（3/101）、26.09%（12/46），平均腹泻发生率10.20%（15/147）；哺乳仔猪腹泻致死率分别为0.99%（1/101）、13.04%（6/46），平均死亡率4.76%（7/147）；哺乳仔猪其他原因致死率分别为1.98%（2/101）、4.35%（2/46），平均为2.72%（4/147）；哺乳仔猪断奶成活率分别为97.03%（98/101）、82.61%（38/46），平均断奶成活率为92.52%（136/147）[9]。试验表明，GG♂×GG♀选配后代哺乳仔猪腹泻发生率、腹泻致死率、哺乳仔猪断奶成活率优于GG♂×GA♀选配后代。2016年进一步研究GG♂×GG♀、GA♂×GA♀两种选配组合后代抗腹泻基因在选留后备种猪中分布，以期在杜洛克种猪抗腹泻后代中采取较合理的基因型选配组合，提高GG型抗腹泻后代选留成功率。

1 材料与方法

1.1 样品

本试验在美系杜洛克2种选配组合（GG♂×GG♀、GA♂×GA♀）后代中，选留体型外貌符合杜洛克种用要求的后代（包括F1代、F2代）24头，于2016年8月3日采耳组织样2～3 g，放入75%乙醇的离心管中冷链保存，送贵州大学动物科学院实验室进行抗腹泻基因的检测研究。样品-20℃保存，采用天根生化科技（北京）有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒制备基因组DNA，作为PCR检测的模板。

1.2 主要试验仪器设备

①离心机（Avanti-J30I），美国贝克曼库尔特公司生产；②制冰机（banshen），美国Grant公司生产；③凝胶成像系统（GelDocXR），美国Bio-rad公司生产；④荧光定量PCR仪（MyCycler），美国Bio-rad公司生产；⑤标准型净化工作台（SW-CJ-IFD），上海锦星科学仪器有限公司生产；⑥电泳仪（DYY．III2稳压电泳仪），北京六一仪器厂生产；⑦-80℃超低温冰箱，美国Thermo公司生产；⑧水浴恒温锅（SHZ-82），中国金坛市医疗仪器厂生产。

1.3 PCR扩增

根据GenBank上公布的猪MUC13基因序列设计4条特异性的引物（表1），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

表1 引物序列

PCR反应体系为10 μL：2×PCR mix 5.0 μL，引物（10 pmol/L）各0.5 μL，基因组DNA（100 ng/μL）1.0 μL，双蒸水补足10 μL体积。扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃/63℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 试验结果

2.1 基因型检测结果

将得到的特异性173 bp条带定为A基因，83 bp条带定为G基因；那么得到1个173 bp条带的样品则定义为AA基因型，得到1个83 bp条带的样品定义为GG基因型，如得到2个条带即为杂合的AG基因型。检测结果见图1。

图1 GG基因型（左）和AA基因型（右）

2.2 克隆测序

将得到的目的173 bp和83 bp两种条带分别切胶回收，连接T-载体，送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行基因克隆测序，证实扩增片段确为MUC13基因，位于内含子7当中，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型为G或A。

2.3 基因型频率和基因频率

由表2可知，结果检出GG型个体16头（3公13母），GA型个体8头（5公3母），AA型个体0头。

表2 杜洛克种猪不同配种方案后代初选后备猪抗腹泻基因检测结果

从表2可以看出，按照GA♂×GA♀组合选配方案，采用常规选留方法—即体型外貌和生长发育状况，从1窝断奶仔猪中初步选留8头为后备猪，对选留的8头后备猪进行抗腹泻基因检测，检出GA型个体8头，未检出GG、AA型个体。检测结果提示，选择此配种方案，其后代常规选留仔猪检出抗腹泻基因GG型个体几率相对小。按照GG♂×GG♀方案选配，从9窝不同父母本选配所生F1代中，每窝选留符合种用要求的后代1～2头，共计11头种猪，采样作MUC13基因型检测，选留11头均为腹泻抗性有利基因GG型个体；将F1代按照GG♂×GG♀方案选配，所生的1窝F2代仔猪中选留符合种用要求的5头仔猪为后备猪，检测结果显示5头均为腹泻抗性有利基因GG型个体，说明父母本按照GG♂×GG♀选配方案，其后代可以稳定遗传抗腹泻基因GG型。

由表3可知，GG基因型频率为66.67%（16/24）、GA基因型频率为33.33%、AA基因型频率为0；G基因频率为83.33%、A基因频率为16.67%。

表3 基因型频率和基因频率

3 分析与讨论

3.1 建立杜洛克种猪抗腹泻新品系的思路

抗性育种是种猪育种发展的重要方向，优质抗病种猪新品种（系）的培育是一项复杂的系统工程，传统的常规选育技术难以获得有效的遗传进展。根据近年来对杜洛克种猪抗腹泻新品系选育研究总结分析，选育种猪抗性新品系选育时，对杜洛克后备种猪和基础种猪进行选择时，可以采用如下方法进行。

3.1.1 组建杜洛克种猪抗腹泻基础群 了解试验猪群腹泻基因有利基因型GG、有利基因G频率，该试验猪群于2007年从美国引进，经纯繁扩群。2009年底，采基础猪群耳组织样，送往江西农业大学进行抗腹泻基因检测，结果表明，在MUC13基因的抗性等位基因频率方面，该试验猪场杜洛克群体中基础猪群腹泻有利基因GG型频率高达86.05%（37/43），G基因频率为0.91，而在长白、大约克群体腹泻有利基因GG型频率、G基因频率分别为40.74%（11/27）、0.70和16.79%（23/137）、0.61[9-10]。显然，杜洛克猪群比大约克、长白猪群较容易选育纯合腹泻抗性GG型个体。因此，在摸清猪场杜洛克基础繁殖群MUC13基因型比例的情况下，我们在腹泻抗性新品系选育前期，对杜洛克种猪基础群全部采样，进行腹泻基因检测，尽可能选留腹泻抗性基因GG型个体，组建杜洛克种猪抗腹泻基础群（包括种公猪及种母猪），根据系谱将符合选配计划的种猪按照GG♂× GG♀选配，其所生的仔猪均为腹泻抗性GG型个体，从中选留优良个体作为后备猪进行扩繁，最终建立杜洛克抗腹泻专门化新品系。

3.1.2 培育出的新品系应有丰富的血统及优良的生产性能 在新品系选育中，种猪选留必须充分考虑血统、繁殖性能、体型外貌等指标，为保证培育的新品系有丰富的血统及优良的生产性能表现，必须尽可能保留繁殖性能较为优秀的GA、AA基因型个体，按照GA♂×GG♀、GG♂×GA♀、GG♂×AA♀、AA♂×GG♀等选配组合进行配种，在不同选配组合F1代或F2代甚至F3代仔猪中，对符合种用条件的仔猪采样检测抗腹泻基因，逐渐选留出不同血统的抗腹泻后代，再逐步淘汰腹泻易感型基因型GA和AA的父母本。因此选育多个血统纯种抗腹泻新品系所需的时间更长。

3.2 抗性新品系建立后及时导入新的血缘

建立健全抗性新品系后，要及时引种导入新的血缘，避免近交导致生产性能下降。对新引进的种猪进行抗腹泻基因检测，加大抗腹泻基因GG型个体选育力度，将GG基因型的优良个体引入新品系中。在美系杜洛克猪群中选育抗腹泻专门化新品系较大约克、长白猪群容易。实际生产中，猪场引种并非是一件容易的事，需要花费较高的费用，尤其是在新品系培育后及时引种导入新的血缘，要保证引进种猪携带有纯合抗腹泻GG基因型，且生产性能、体型外貌等指标优良，需要对引进种猪进行一次抗腹泻GG型选育，这就需要更长的时间才能完成抗性新品系的培育。在实际育种生产中，如果整窝仔猪都进行抗腹泻基因检测，并且只选留GG型的个体作为后备猪，选留的后备猪生长发育到配种阶段，体型外貌、生长发育可能发生改变，不一定能满足留种要求，这不仅增加基因检测成本，无形中也增加新品系选育的饲养成本。如果是按照常规选育，根据体型外貌、繁殖性能表现等选留优秀个体作为后备猪，在配种前对优秀个体进行抗腹泻基因检测，所预留的后备猪中也不一定都检出抗腹泻基因GG型个体，或许只有一定比例的后备猪检出抗腹泻GG型，因此，采用这种常规选留后备猪的方案，就要按照选留计划选留足够数量的后备猪。因此制定科学的选配方案，对提高后代抗腹泻基因GG基因型频率及G基因频率是至关重要的，可加快抗性新品系选育进程。

3.3 抗腹泻杜洛克种猪在杂交生产中利用

杜洛克抗性腹泻新品系种猪在二元及三元杂交生产中，杂交后代抗腹泻情况有待于进一步深入研究。

[1]Shepard S M,Danzeisen J L,Isaacson R E,et al.Genome sequences and phylogenetic analysis of K88 and F18-positive porcine enterotoxigenic Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology,2012,194(2):395-405.

[2]Joller D,Jorgensen C B,Bertschinger H U,et al.Vogeli P Refined localization of the Escherichia coli F4ab/F4ac receptor locus on pig chromosome 13[J].Animal Genetics,2009,40(5): 749-752.

[3]Ren J,Yah X,Ai H,et al.Susceptibility towards enterotoxigenic Escherichia coli F4ac diarrhea is governed by the MUC13 gene in pigs[J].PLoS One,2012,7(9):e44573.

[4]Pearce G P.Epidemiology of entericdisease in grower-finisherpigs:apostal survey of pig producers in England[J].The Veterinary record,1999,144:338-342.

[5]Johansen M,Alban L,Kjærsgaard H D,et al.Factors Influencing the Weight Gain of Piglets[C]//Proceedings of the 17th International Pig Veterinary Society Congress(Iowa,U.S.A),2002,1:227.

[6]赵明军，闰若潜，盛敏，等.仔猪腹泻病流行形势与防控措施[J].养猪，2013（2）：109-110.

[7]龙清孟，熊胜利，龚菲，等.从规模化猪场仔猪死亡数据分析研究提高仔猪成活率对策[J].猪业科学，2014（8）：113-116.

[8]王红宁.仔猪腹泻成因及综合防治技术措施[J].中国畜牧杂志，2006，42（6）：58-60.

[9]熊胜利，龙清孟，陈大芳，等.抗病育种技术在引进美国SPF种猪后代选育中应用探究[J].养猪，2014（3）：73-74.

[10]龙清孟，熊胜利，龚菲，等.引进美国SPF杜洛克种猪抗腹泻基因检测及后代选育研究[J].养殖与饲料，2013（12）：11-12.

（感谢贵州大学动物科学学院冉雪琴教授对项目研究的大力帮助！）

（编辑：富春妮）

练太极可缓解抑郁症

【美国每日科学网站5月25日报道】题：太极显著缓解华裔美国人的抑郁症状

在没有接受其他任何治疗的情况下，一项为期12周的接受指导和习练中国太极的计划让从事这项中国武术运动的华裔美国人的抑郁症状出现显著缓解。美国马萨诸塞综合医院研究人员开展的这一试点研究招募了一些患有轻度到中度抑郁症的波士顿华人居民，研究结果刊登在《临床精神病学杂志》上。

研究报告的第一作者、该医院精神病学科抑郁症临床与研究计划的艾伯特·杨说：“虽然此前的一些研究表明太极可能有助于治疗焦虑和抑郁，不过在大多数情况下，它是作为治疗其他疾病的辅助手段，而不是用来针对抑郁症患者。发现太极可能有效治疗抑郁症这一点意义重大，因为华人群体的患者在文化上认同这种运动，而且他们往往不愿采取常规的精神病学疗法。”

参与者是通过广告招募的，研究人员在与他们进行当面沟通并对他们的总体健康状况及抑郁症状进行评估后，才确定他们是否能够参与这项研究。入选条件包括：普通话或粤语流利、是华裔成年人、被确诊患有轻度到中度的抑郁症、没有其他精神病史、近期没有习练过太极或其他身心疗法、当时没有接受其他精神疾病治疗。

参与者被随机分成三组：第一组接受太极疗法；第二组采取参与教育课程的主动形式，其中包括就压力、心理健康和抑郁展开讨论；还有就是被动“等待”的第三组，仅在研究期间及之后一再地接受评估。

太极疗法是在12周里每周练习两次，在此期间参与者会学习并习练一些基础的太极动作。他们每周要在家里练三次太极，而且将习练过程记录下来。第二组的参与者在12周里每周有两次课。在最初的研究阶段过后，第二组和第三组的成员都可以免费参与太极课程；这一点在研究之初就已告知他们。

成功度过为期12周的干预期的50名参与者当中，17人在太极组，14人在教育组，还有19人在等待组。12周后的评估表明，太极组的抑郁症状比另外两组都有明显改善。24周以后的后续评估显示，太极组抑郁症状在持续改善，明显不同于等候组。

杨说：“如果这一研究结果在其他地方的更大规模研究中得到证实，就表明太极有可能是几乎不到心理健康机构就医的中国患者及华裔美国患者治疗抑郁症的重要方法，而且可能有助于解决心理健康医师短缺的问题。我们还应研究太极是否会对其他种族和民族的人群产生类似的影响，并弄清产生这些有益影响的是太极的哪些方面。”

（转自参考消息[N]，2017-05-28）

S828.8

A

1002-1957(2017)04-0049-04

2017-06-06收稿，2017-07-03修回

贵州省农业攻关课题[黔科合NY字（2012）3061号]；贵州省农委2009年立项—引进美国良种猪场口蹄疫、猪瘟等重大传染性疾病防控技术研究

熊胜利（1967-），男，贵州毕节人，高级畜牧师，主要从事育种及技术推广研究工作.E-mail:xshli@163.com

冉雪琴（1968-），女，重庆人，教授，硕士生导师，博士，研究方向为动物生理学与分子生物学.E-mail:rxueq@yahoo.com.cn