糖肾平对糖尿病肾病KKAy小鼠肾脏保护作用及对RhoA/ROCK信号通路影响的研究＊

苗永辉，赵宗江，张新雪，杨美娟，杨冠男，吴阿敏，王婷

糖肾平对糖尿病肾病KKAy小鼠肾脏保护作用及对RhoA/ROCK信号通路影响的研究＊

苗永辉，赵宗江＊＊，张新雪，杨美娟，杨冠男，吴阿敏，王婷

（北京中医药大学中医学院北京100029）

目的：探讨糖肾平对糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）KKAy小鼠肾保护作用及其对RhoA/ROCK信号通路的影响。方法：雌性10周龄SPF级KKAy小鼠60只，KK鼠料诱导10周建立DKD模型，随机分为模型组、厄贝沙坦组、糖肾平低（0.525 g·kg-1）、中（1.05 g·kg-1）、高（2.1 g·kg-1）剂量组，10只雌性C57BL/6J小鼠为正常组。各治疗组灌胃给药，正常组、模型组灌胃等体积去离子水，每4周称体质量并测24 h尿蛋白定量。第26周小鼠麻醉后摘眼球取血，称肾质量、测空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）、血肌酐（Serum creatinine，Scr）和甘油三酯（Triglyceride，TG）含量；HE、Mallory和PAS染色观察肾组织病理；免疫组化、原位杂交测肾组织转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene familymember A，RhoA）、Rho相关卷曲蛋白激酶（Rho-associatedcoiledcoil-containing protein kinase 1，ROCK1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA）、E-钙黏素（ECadherin，E-Cad）mRNA及蛋白表达。结果：与模型组相比，各治疗组体质量、肾质量/体质量、尿蛋白降低，糖肾平中、高剂量组有显著性差异（P＜0.01）；肾病理损害明显减轻，FBG、BUN、Scr、TG含量降低（P＜0.01），ECadherin mRNA及蛋白表达增加，TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMA mRNA和蛋白表达减少，糖肾平中、高剂量组差异显著（P＜0.01）。结论：糖肾平对DKD KKAy小鼠肾的保护作用及抑制肾小管上皮细胞转分化的作用，可能与调节RhoA/ROCK信号通路有关。

糖尿病肾病糖肾平肾痿KKAy小鼠RhoA/ROCK通路肾小管上皮细胞转分化

随着中国经济的发展，人群生活方式的转变，我国在过去30年，糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）发病率迅速上升，约9.7%[1]，其中20-30%进一步发展为糖尿病肾病（DKD），DKD是DM众多并发症中较棘手的一种，同时也是引起终末期肾病（End Stage Renal Disease，ESRD）的主要原因之一[2]。研究表明，肾小管上皮-间质转分化（Epithelial-to-Mesenchymaltransition，EMT）参与了DKD的发病过程，是引起DKD晚期肾间质纤维化，导致肾脏功能丧失的重要因素[3]，而RhoA/ROCK信号通路是参与肾小管上皮细胞EMT的过程的主要信号转导通路之一[4]。目前，西医对DKD的治疗是使用血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotension Converting Enzyme Inhibitors，ACEI）和血管紧张素受体阻滞剂（Angiotensin Receptor Blocker，ARB）来降低蛋白尿，而中药治疗DKD具有显著优势。临床应用中药复方糖肾平治疗DKD获得了较满意的效果，它是在“肾痿”科学假说的指导下组方而成。本课题组前期研究表明，糖肾平能有效抑制甚至逆转DKD肾脏EMT过程[5]。本研究通过实验进一步探索糖肾平对DKD肾脏的保护作用和对肾小管上皮细胞EMT抑制作用的分子机制，为“肾痿”科学假说提供数据支持。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级8-10周龄健康KKAy雌性小鼠60只，SPF级健康8-10周齡雌性C57BL/6J小鼠10只均购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证编号：SCXK京2014-0004；KK鼠专用配合饲料（北京华阜康生物科技有限公司，专利号：CN102648734A，11003800003551）；普通鼠饲料（北京华阜康生物科技有限公司，11003800004265）。实验小鼠置于洁净动物橱（北京文慧净化设备厂制造，专利号：EJ932041477）中饲养，适应性喂养1周，普通饲料进食，自由饮水。

1.2 试药与试剂

糖肾平（生黄芪6 g、熟地黄3 g、山萸肉2 g、翻白草3 g、白花蛇舌草3 g、水蛭2 g，北京中医药大学中药学院制剂室制备，批号：2016008，保质期2年）；厄贝沙坦片（法国赛诺菲安万特公司，进口药品注册证号：H20130118）。

免疫组化一抗：TGF-β1（英国Abcam公司，批号：ab92486/GR253274-1）；RhoA（美国Novus Biologicals公司，批号：NB100-91273/Rb0322-200308-WS），ROCK1（英国Abcam公司，批号：ab134181/GR149410-2），α-SMA（英国Abcam公司，批号：ab32575/GR32377-41），E-Cadherin（英国Abcam公司，批号：ab76055/ GR216035-1）；二抗：山羊抗兔（英国Abcam公司，批号：ab6721/GR231489-1）；山羊抗鼠（英国Abcam公司，批号：ab6789/GR215715-5）。

原位杂交探针：TGF-β1（天津灏洋生物工程有限公司，批号：BSH0087F/20150521）；RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin（武汉博士德生物工程有限公司，批号：MK3748-m/02042TW60708152060LG、MK2200-m/ 02041TW60708149060LG、MK3558/01906TW50917112-059VI、MK1181/01908TW50917115050VI），探针序列分别为：TGF-β1：5′-AGCCCTGTATTCCGTCTCCTTG⁃GTTCA-3′；RhoA：5′-GAAGAAAAAGTCTGGGTGCCT⁃CATCTTGTGAAGCCTTGTGA-3′；ROCK1：5′-TTTACATATTATAGCAATCGTAGATACTTACCTCC-3′；α-SMA：5′-TGTGAAGAGGAAGACAGCACAGCCCTGGTGTGC⁃GACAATGGCTCT-3′；E-Cadherin：5′-AACGATCCT⁃GACCAGCAGTTCGTTGTTGTCACAGA-3′。

2 实验方法

2.1 DKD KKAy小鼠模型的建立与分组

所有小鼠均适应性喂养1周，自由进食饮水，KKAy小鼠进食KK鼠专用配合饲料；C57BL/6J小鼠进食普通饲料。诱导喂养10周后，尾静脉采血测血糖，代谢笼收集小鼠24 h尿液，当随机血糖＞16.7 mmol·L-1，24 h尿蛋白＞0.4 mg时确认为DKD动物模型建立。造模成功的小鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组（每天50 mg·kg-1）、糖肾平低剂量组（0.525 g·kg-1）、糖肾平中剂量组（1.05 g·kg-1）、糖肾平高剂量组（2.1g·kg-1），灌胃给药；对照组、模型组小鼠用等体积去离子水灌胃，灌胃剂量按10 mL·kg-1体质量系数，治疗16周。

2.2 观察指标

2.2.1 一般情况

观察小鼠的皮毛外观、精神状态、进食饮水情况、活动量等，每4周称量体质量。

2.2.2 24 h尿蛋白定量测定

小鼠24 h尿液使用代谢笼收集，用BCA法检测尿蛋白浓度，计算24 h尿蛋白含量，每4周检测一次。

2.2.3 血液生化指标的检测

股动脉取血，检测血尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）的含量。

2.2.4 肾组织病理学分析

干预16周后取材，无菌摘取肾脏，肾组织常规固定、石蜡包埋、切片，分别进行HE、Mallory和PAS染色。

2.2.5 免疫组化

取4℃保存石蜡切片，复温，Triton，H2O2-CH3OH，分别孵育10 min；抗原修复液，微波炉加热到98℃，自然冷却至室温；20%蛋清，37℃孵育30min，10%山羊血清，37℃孵育60min，一抗4℃过夜；二抗，37℃孵育30 min，DAB显色10 min，苏木素复染，返蓝l0 min，树胶封片。

2.2.6 原位杂交

取-20℃保存石蜡切片，复温，Triton，H2O2-CH3OH，分别孵育10 min；复合消化液，6 min；37℃预杂交，2 h，37℃杂交5 h，SSC梯度冲洗，封闭液，37℃，30 min。生物素标记Digoxin，4℃过夜；高敏过氧化物酶亲和素37℃，20 min，生物素化过氧化酶，37℃，20 min，DAB显色15 min，苏木素复染，返蓝l0 min，树胶封片。具体步骤参照文献[9]。

2.3 图像分析

应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，棕黄色颗粒为阳性表达，每组随机选取8-12个视野，测定OD值。

2.4 统计学方法

SPSS 22.0统计软件进行数据分析，数据用（xˉ±s）表示，采用单因素方差分析进行比较，P＜0.05认为有统计学差异，P＜0.01认为有显著性统计学差异。

3 实验结果

3.1 一般情况

通过连续无间断的喂养KKAy小鼠KK专用饲料后，糖尿病肾病KKAy小鼠出现精神萎靡，活动量明显减少，皮毛失去光泽，毛色暗淡，进食饮水量较C57/6J小鼠明显增大，同时增多的也包括24 h尿量。饲养大约10周时，皮肤溃疡和尿路感染等糖尿病并发症出现。相对于模型组小鼠，厄贝沙坦及糖肾平各组小鼠的一般状况有所改善。

3.2 糖肾平对DKD小鼠体质量及肾质量/体质量的影响

随着实验进行，糖尿病肾病KKAy小鼠的体重逐渐增加，DKD小鼠和C57BL/6J小鼠体重之间出现显著差异（P＜0.01）；由表可知尽管治疗组小鼠体重也随时间延长缓慢增加，但从第18周起，除糖肾平低剂量组外，各用药组小鼠体重与模型组相比体质量下降，糖肾平各组中高剂量组体质量下降最为明显（P＜0.01）。到第26周，与正常小鼠相比，模型组DKD小鼠肾质量/体质量比值显著增大（P＜0.01）；与模型组比较，糖肾平各治疗组该比值均显著减小（P＜0.01），高剂量组该比值下降程度最显著（表1、图1、图2）。

3.3 糖肾平对DKD KKAy小鼠24 h尿蛋白的影响

由表2、图3可知：每四周测24 h尿蛋白定量，模型组小鼠24 h尿蛋白定量随着时间的推移逐渐增加，且明显高于正常组小鼠（P＜0.01）；第14周与模型组相比，糖肾平组24 h尿蛋白明显降低（P＜0.05）。虽然在第18周、第22周尿蛋白有少量增加，但糖肾平组小鼠平均尿蛋白明显低于模型组小鼠（P＜0.05），中、高剂量组差异更显著（P＜0.01）。

3.4 糖肾平对DKD KKAy小鼠FBG、血清BUN、Scr和TG的影响

与正常组比较，模型组小鼠FBG明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，糖肾平中、高剂量组FBG降低（P＜0.05）。与正常组相比，模型组BUN、Scr、TG显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，糖肾平各组BUN、Scr、TG降低，其中糖肾平高剂量组血清BUN改变有显著性差异（P＜0.01）。详见表3。

表1 糖肾平对DKD KKAy小鼠体质量和肾质量/体质量的影响（xˉ±s,n=8）

图1 糖肾平对DKD KKAy小鼠体质量的影响

图2 糖肾平对DKD KKAy小鼠肾重体重比的影响

表2 糖肾平对DKD KKAy小鼠24 h尿蛋白的影响/mg（xˉ±s,n=7）

3.5 糖肾平对DKD小鼠肾组织病理形态的影响

正常组C57BL/6J小鼠肾脏可见正常肾小球和肾小管结构；与正常组相比，模型组KKAy小鼠肾脏可以看到肾脏组织存在糖尿病肾病特征性病理改变，如肾小球肥大，肾小球系膜细胞及基质重度增生，肾小球基底膜增厚，肾小球结节硬化，肾间质大量炎症细胞浸润，部分肾小管萎缩等，可看到透明管型和大量胶原纤维沉积；与模型组相比，各个给药组以上病理表现都有不同程度减轻，糖肾平高、中剂量组比低剂量组改善更明显，胶原纤维沉积最少，可见中度的胶原纤维沉积（图4、图5、图6）。

3.6 糖肾平对肾组织TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin mRNA表达的影响

由表4及图7、图8、图9、图10、图11、图12可知：与正常组相比，模型组E-Cadherin mRNA表达明显减少，TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMAmRNA表达显著增多，可见更多的棕黄色颗粒（P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组E-Cadherin mRNA的表达量明显增加，TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMA mRNA的表达明显减少，其中糖肾平高剂量组差异显著（P＜0.01）。

图3 糖肾平对DKDKKAy小鼠24 h尿蛋白定量的影响

3.7 糖肾平对肾组织TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin蛋白表达的影响

正常组大量表达E-Cadherin，可见大量棕黄色颗粒，少量表达TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMA，均为棕黄色颗粒显色；与正常组相比，模型组E-Cadherin蛋白表达显著减少，TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表达明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组E-Cadherin的表达明显增加，TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMA的表达量明显减少，其中糖肾平高剂量组有显著性差异（P＜0.01），糖肾平的治疗效果与给药剂量相关（表5及图12、图13、图14、图15、图16）。

表3 糖肾平对DKD KKAy小鼠FBG及血清BUN、Scr的影响（xˉ±s）

图4 各组肾组织HE染色（×400）

图5 各组肾组织Mallory染色（×400）

图6 各组肾组织PAS染色（×400）

表4 糖肾平对肾组织TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin mRNA表达的影响（xˉ±s,n=8）

4 讨论

中医按照糖尿病肾病病人水肿、蛋白尿等临床表现，将其归于“水肿”、“尿浊”、“关格”、“腰痛”及“肾消”、“消渴肾病”等范畴。糖尿病肾病日久，热、郁、痰湿、瘀血、毒邪胶结于肾脏，阻滞气血运行，使肾脏结构破坏，“肾体”受损，肾脏结构破坏必然最终导致肾脏正常功能受损甚至丧失，即“肾用”失常，“肾体”和“肾用”均受到损害。长此以往，肾脏痿废不用，发为“肾痿”，“肾痿”一词，不仅概括了其病机，也描述了疾病的最终状态。本病的病性总属本虚标实，虚则以正气亏虚为本，实则以痰浊、湿热、瘀毒结聚为标，并贯穿于“肾痿”整个发展过程，其中瘀血是引起并导致“肾痿”不断发展的最关键致病因素，消渴肾病迁延日久，阴虚燥热耗伤气阴，导致气阴两虚，结合“久病入络”理论，气虚则行血无权，阴虚则火旺伤津，血行瘀滞，初为气阴两虚，后由虚致实，瘀血内生，阻滞肾络，反映在肾脏病理表现上则可见肾小球硬化，肾小管上皮细胞重吸收障碍，空泡样变，间质纤维化等。

图7 糖肾平对DKD KKAy小鼠肾组织TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA、E-Cadherin mRNA

图8 糖肾平对各组肾组织TGF-β1mRNA表达的影响（×400）

图9 糖肾平对各组肾组织RhoA mRNA表达的影响（×400）

图10 糖肾平对各组肾组织ROCK1 mRNA表达的影响（×400）

图11 糖肾平对各组肾组织α-SMAmRNA表达的影响（×400）

图12 糖肾平对各组肾组织E-CadherinmRNA表达的影响（×400）

表5 糖肾平对肾组织TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin蛋白表达的影响（xˉ±s,n=8）

图13 糖肾平对各组肾组织TGF-β1蛋白表达的影响（×400）

“肾痿”科学假说指导组方的糖肾平，药物组成有生黄芪、熟地黄、山萸肉、白花蛇舌草、翻白草、水蛭。方中黄芪健脾益气、利水消肿、固摄精微、利水消肿与减少尿蛋白，为君药；山萸肉、熟地黄共同补益肝肾、生津益气为臣药；白花蛇舌草清热解毒、消痛散结、利尿除湿，翻白草清热、解毒消肿为佐药；水蛭为使，活血化瘀，通达经络，引诸药直达肾络。组方特点为补而不滞，祛瘀不伤正，治疗DKD之气阴两伤、瘀血阻络者最为适宜[6]。

图14 糖肾平对各组肾组织RhoA蛋白表达的影响（×400）

图15 糖肾平对各组肾组织ROCK1蛋白表达的影响（×400）

图16 糖肾平对各组肾组织α-SMA蛋白表达的影响（×400）

图17 糖肾平对各组肾组织E-Cadherin蛋白表达的影响（×400）

本实验采用的是自发性Ⅱ型糖尿病动物模型KKAy小鼠，其DKD的发生是遗传因素为内因加外因高脂饲料诱导，与人类该病的发病特点非常相似，故本实验选择KKAy小鼠进行实验研究，C57BL/6J小鼠与KKAy小鼠具有基因同源性，选择其作为正常组[7-11]。本实验在KKAy小鼠遗传易感的基础上饲以高脂饲料，造成外周组织对胰岛素敏感性降低，增加其Ⅱ型糖尿病的发病率。KKAy小鼠的血糖随着年龄增长而升高，8周龄时伴随有轻微肾脏结构改变，如肾小球基底膜增厚等，入组的KKAy小鼠测空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG）≥16.7 mmol∙L-1，体质量明显增加且其多饮多尿、肥胖、糖耐量减低等Ⅱ型糖尿病特征明显，尿蛋白含量升高，肾小球肥大和严重的系膜增生，系膜区增宽，肾小球壁层上皮增生，间质炎性浸润，部分小管萎缩，并可见较多透明管型，大量胶原纤维沉积，这些改变均可导致和加重DKD肾间质纤维化的发生。

本实验研究发现，中药复方糖肾平水煎剂可改善自发Ⅱ型DKD KKAy小鼠的一般状态，改善其脂类代谢，降低其体质量，降低DKD KKAy小鼠肾重体重比，减少尿蛋白，降低中BUN、Scr、TG含量，减轻肾脏病理改变，且高剂量组疗效最为显著。

TGF-β1既能够作为独立因素诱导DKD肾脏EMT的发生，也可以参与信号通路的构成，作为相关信号转导通路的一个环节，参与EMT的发生、发展，如DKD发生时，TGF-β1可激活肾脏中的RhoA/ROCK信号转导通路。TGF-β1激活RhoA/ROCK信号通路，进一步诱导EMT过程中的α-SMA表达，在这个过程中，Rho起核心作用[12]。实验结果表明，DKD KKAy小鼠肾组织中TGF-β1、RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白及mRNA表达水平显著升高，E-Cadherin蛋白及mRNA表达水平显著降低。给药治疗后，DKD KKAy小鼠肾组织TGF-β1、RhoA、ROCK1、α-SMA蛋白及mRNA的表达降低，与细胞间粘附作用密切相关的E-Cadherin蛋白及mRNA表达升高，基于以上结果推测，糖肾平可能是通过RhoA/ROCK信号转导通路在一定程度上抑制肾小管上皮细胞的EMT来保护肾功能的。

综上所述，糖肾平对DKD KKAy小鼠的肾脏具有明显的保护作用并且能够逆转肾小管上皮-间质转分化，抑制DKD肾间质纤维化，进而延缓DKD的疾病进展，糖肾平属于中药复方，其对DKD的治疗作用具有多靶点性，本研究只涉及了一个方面，因此还需进一步实验进行更深层次机制的研究。另外，需要提出的是，在临床治疗和实验研究中常使用糖肾平煎剂，因为同一个中药的不同剂型和有效成分的不同提取方式会对其治疗效果产生重要的影响，这是由中医药自身的特点所决定的。因此在以后的实验研究中，可以尝试突破现有中药有效成分提取的技术常规和瓶颈，突破以往常规的中药有效成分提炼方法，通过实验探索出中药复方糖肾平的更有效的剂型或提纯方式，进一步增强其药效，同时完善和充实我国中药复方实验研究的内容，也为相关的科学研究提供有益的借鉴。

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Renoprotective Effects of Tang-Shen-Ping on RhoA/ROCK Signaling Pathway in Diabetic Kidney Disease KKAy Mice

Miao Yonghui,Zhao Zongjiang,Zhang Xinxue,Yang Meijuan,Yang Guannan,Wu Amin,Wang Ting
(College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

This study was aimed to explore the renoprotective effects of Tang-Shen-Ping(TSP)on RhoA/ROCK signaling pathway in KKAy mice with diabetic kidney disease(DKD).A total of 60 female 10-week SPF degree KKAy mice,which were fed with KK special food for 10 weeks,were made into DKD model.Mice were randomly divided in the model group, irbesartan group,low-,medium-and high-dose TSP group(0.525 g·kg-1,1.05 g·kg-1,and 2.1 g·kg-1).Ten female C57BL/6J mice were used as the normal control group.Mice of each group were intragastrically administered with corresponding medicine,respectively,while mice of the control group and the model group were given deionized water of the equal volume.The body weight was measured and the 24-hour urine protein quantification was detected every 4 weeks.At the end of the 26th week,all mice were sacrificed and the biochemical indicators,such as fasting blood glucose (FBG),serum blood urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr),and triglyceride(TG)were measured.HE staining, Mallory staining and PAS staining were used to observe the pathological morphology of kidney tissues.Immunohistochemistry (IHC)and in situ hybridization(ISH)were used in the detection of transforming growth factor-β1(TGF-β1),Ras homolog gene family member A(RhoA),Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1(ROCK1),α-smooth muscle actin(α-SMA),E-Cadherin(E-Cad)mRNA and protein expression.The results showed that compared with the model group,there were significant differences on body weight,the ratio of kidney weight to body weight,and urinary protein in the middle-and high-dose TSP group(P＜0.01);the renal pathological damage was obviously decreased;contents ofFBG,BUN,Scr and TG decreased(P＜0.01);mRNA and protein expression of E-Cadherin increased;mRNA and protein expression of TGF-β1,RhoA,ROCK1 and α-SMA decreased with significant difference in the middle-and highdose TSP group(P＜0.01).It was concluded that the renoprotective effects and epithelial-mesenchymal transdifferentiation (EMT)of renal tubular epithelial cells of TSP on DKD KKAy mice may be related to the regulation of RhoA/ROCK signaling pathway.

Diabetic kidney disease,Tang-Shen-Ping,consumptive kidney disease,KKAy mice,RhoA/ROCK signaling pathway,epithelial-mesenchymal transdifferentiation of renal tubular epithelial cells

10.11842/wst.2017.06.025

R285.5

A

（责任编辑：郭嫦娥，责任译审：王晶）

2017-04-28

修回日期：2017-05-20

＊国家自然科学基金委面上项目（81373831）：基于“肾痿”组方的糖肾平干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化的分子机制研究，负责人：赵宗江。

＊＊通讯作者：赵宗江，本刊编委，教授，博士生导师，主要研究方向：中医药防治糖尿病肾病的机制研究。