白藜芦醇增强乳腺癌细胞对γδT细胞的敏感性及其机制研究

黄玲燕

白藜芦醇增强乳腺癌细胞对γδT细胞的敏感性及其机制研究

黄玲燕

目的探讨γδT细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性，观察白藜芦醇增强γδ T细胞的抗肿瘤活性。方法体外扩增培养人γδT细胞并用流式细胞术进行鉴定。实验分为对照组、白藜芦醇组、γδT细胞组、白藜芦醇+γδT细胞组及白藜芦醇+γδT细胞+c-FLIP质粒组。LDH释放实验检测γδT细胞对MDA-MB-231乳腺癌细胞的杀伤活性；western blot实验检测白藜芦醇及γδT细胞处理后MDA-MB-231细胞的细胞Fas-相关性死亡结构域样白介素-1β转换酶抑制蛋白（c-FLIP）的表达水平、活化半胱天冬酶（caspase）8、caspase 9、caspase 3的活化和细胞色素c的释放。结果流式细胞实验结果显示在体外用BrHPP和IL-2培养14天的人单个核细胞、CD3和γδTCR，确定这些定向培养的效应细胞为γδT细胞。LDH释放实验显示γδT细胞+白藜芦醇组对MDA-MB-231的杀伤活性为（68.2±7.1）%，显著高于γδT细胞组的（21.4±3.2）%（P<0.05）和白藜芦醇+γδT细胞+c-FLIP质粒组的（27.9±3.6）%（P<0.05）。Western blot实验结果显示白藜芦醇处理能显著降低MDAMB-231细胞中c-FLIP蛋白的表达，γδT细胞+白藜芦醇组MDA-MB-231的活化caspase 8及细胞色素c的释放均显著高于γδT细胞组和白藜芦醇+γδT细胞+c-FLIP质粒组。结论白藜芦醇下调乳腺癌细胞c-FLIP的表达，提高乳腺癌细胞对γδT细胞的敏感性。

乳腺癌；MDA-MB-231细胞；γδ T细胞；白藜芦醇；c-FLIP基因

乳腺癌是女性群体中发病率最高的恶性肿瘤，而且患者的5年生存率较低，严重危害女性健康[1]。手术是目前治疗乳腺癌最有效的手段，化疗或免疫治疗是术后不可缺少的巩固治疗手段[2]。近期的研究已经将一些免疫效应细胞作为药物进行临床试验，用于肿瘤的治疗[3]。γδ T细胞是T细胞的一个亚群，其表面的T细胞受体（TCR）由γδ肽链组成，能直接杀伤肿瘤细胞而不需要通过MHC分子进行抗原提呈。然而肿瘤细胞对γδ T细胞单独治疗的敏感性较低[4]，因此辅以其它药物提高乳腺癌细胞对γδ T细胞的敏感性是提高其疗效的有效方法。另外，γδ T细胞能直接杀伤肿瘤细胞，导致肿瘤发生裂解，释放其中的乳酸脱氢酶（LDH），因此检测培养体系中的LDH活性可用于测定γδ T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性[5]。本研究目的在于探讨γδ T细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性并研究白藜芦醇是否能增强γδ T细胞的抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料白藜芦醇购于美国Sigma-Aldrich。乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒和线粒体分离试剂盒购于江苏碧云天生物技术有限公司。DMEM培养基购于美国Gibco。细胞Fas-相关性死亡结构域样白介素-1β转换酶抑制蛋白（c-FLIP）、活化半胱天冬酶-8（cleaved caspase-8）、活化半胱天冬酶-9（cleaved caspase-9）、活化半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）、细胞色素c和β肌动蛋白（β-actin）抗体购于美国Cell Signaling。ECL试剂盒购于美国Pierce。pcDNA3.1质粒和脂质体2000（Lipofectamine2000）购于美国Invitrogen公司。溴代醇磷酸（bromohydrin pyrophosphate，BrHPP）购于法国Innate Pharma。白细胞介素2（IL-2）购于美国R&D system公司。γδ TCR-PE流式细胞抗体和CD3-FITC流式细胞抗体购于美国BD Bioscience公司。

1.2 细胞培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃恒温培养箱中培养并通入5%CO2。γδ T细胞的培养按文献方法[6]，抽取10名健康人的全血采取密度梯度离心法获取单个核细胞并培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，加入3μmol/L γδ T细胞特异性扩增剂BrHPP和400IU/mL的IL-2培养14天。

1.3 γδ T细胞的鉴别培养的γδ T细胞用带PE荧光标记的γδ TCR流式细胞抗体和带FITC荧光标记的CD3流式细胞抗体孵育20min，用生理盐水将细胞清洗3次后用流式细胞仪进行检测。

1.4 c-FLIP过表达质粒构建和转染将c-FLIP基因（Gene ID：NM_001127183.2）的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成c-FLIP重组过表达质粒。c-FLIP过表达质粒用Lipofectamine2000按试剂操作说明书步骤进行转染，将2μg/mL c-FLIP表达质粒转染入MDA-MB-231细胞中。

1.5 乳酸脱氢酶释放实验检测γδ T细胞的杀伤活性首先按文献所示方法[6]将健康人血液中的单个核细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，用γδ T细胞特异性扩增剂BrHPP和IL-2进行体外扩增培养。单个核细胞群体中的γδ T细胞在BrHPP和IL-2的作用下发生增殖。14天后收集细胞，由于只有γδ T细胞高表达CD3和γδ TCR，因此将所收集的细胞用γδ TCR-PE抗体和CD3-FITC抗体进行染色后用流式细胞实验进行鉴定。如图1所示，体外培养后获得的细胞高表达CD3和γδ TCR，确定这些用BrHPP和IL-2体外培养的细胞为γδ T细胞。将γδ T细胞和MDA-MB-231细胞按不同的效靶比（E: T，效应γδ T细胞个数：目标MDA-MB-231靶细胞个数）进行混合共培养。12h后用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒按说明书步骤检测MDA-MB-231细胞乳酸脱氢酶（LDH）的释放率。

图1 γδ T细胞的体外培养鉴别。注：CD3-FITC：异硫氰酸荧光素标记的CD3抗体；γδ TCR-PE：藻红蛋白标记的γδ链T细胞受体抗体

1.6 乳酸脱氢酶释放实验检测白藜芦醇对γδ T细胞杀伤活性的影响实验分为对照组、白藜芦醇组，γδ T细胞组、白藜芦醇+γδ T细胞组及白藜芦醇+γδ T细胞+c-FLIP质粒组。对照组为MDA-MB-231细胞单独培养36h；白藜芦醇组为MDA-MB-231细胞加入10μmol/mL白藜芦醇处理36h；γδ T细胞组为MDA-MB-231细胞单独培养24h后，再加入2.5倍MDA-MB-231数目的γδ T细胞培养12h；白藜芦醇+γδ T细胞组为MDA-MB-231细胞加入10μmol/ mL白藜芦醇处理24h后，再加入2.5倍MDA-MB-231数目的γδ T细胞培养12h；白藜芦醇+γδ T细胞+c-FLIP质粒组为MDA-MB-231细胞先用2μg/ mL c-FLIP质粒和10μmol/mL白藜芦醇处理24h后，再加入2.5倍MDA-MB-231数目的γδ T细胞培养12h。细胞处理完毕后用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒按说明书步骤检测MDA-MB-231细胞乳酸脱氢酶（LDH）的释放率。

表1 γδ T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤活性（）

表1 γδ T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤活性（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与1.25倍γδ T细胞组比较，#P<0.05；与2.5倍γδ T细胞组比较，&P<0.05；与5倍γδ T细胞组比较，□P<0.05；LDH：乳酸脱氢酶

组别对照组1.25倍γδ T细胞组2.5倍γδ T细胞组5倍γδ T细胞组10倍γδ T细胞组孔数E:T（γδ T细胞个数：MDA-MB-231细胞个数）3333301.252.5510 LDH释放率（%）1.6±0.39.5±0.9* 21.2±3.1#50.8±5.1&64.4±6.2□

1.7 线粒体分离将MDA-MB-231细胞按上述进行分组。用线粒体分离试剂盒按试剂说明书步骤将处理后的MDA-MB-231细胞的线粒体从细胞质中分离处理，取细胞质进行后续的Western blot实验。

1.8 Western blot实验将MDA-MB-231细胞按上述进行分组。细胞处理完毕后用蛋白提取液提取MDA-MB-231细胞中的总蛋白质。将等量的总蛋白质用12.5%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用c-FLIP、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、细胞色素c和β-actin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

2 结果

2.1 γδ T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤活性LDH释放实验结果显示E∶T越高，γδ T细胞对MDA-MB-231细胞杀伤活性越强，且呈γδ T细胞剂量依赖性。见表1。

2.2 白藜芦醇提高γδ T细胞对MDA-MB-231的杀伤活性γδ T细胞+白藜芦醇组MDA-MB-231的LDH释放率显著高于γδ T细胞组和白藜芦醇组（P< 0.05），表明白藜芦醇处理能显著提高γδ T细胞对MDA-MB-231的杀伤活性。见表2。

2.3 白藜芦醇通过下调c-FLIP的表达促进γδ T细胞对MDA-MB-231凋亡的诱导western blot实验结果显示白藜芦醇能显著降低MDA-MB-231细胞中c-FLIP的表达水平（图2），提示白藜芦醇对γδ T细胞的增敏作用可能和c-FLIP的下调有关。转染c-FLIP质粒后γδ T细胞联合白藜芦醇对MDA-MB-231细胞的杀伤活性受到明显抑制，表明白藜芦醇发挥γδ T细胞的增敏作用的机制是由于c-FLIP的下调。Western blot实验显示白藜芦醇能通过c-FLIP的下调显著促进γδ T细胞对caspase-8的活化，从而促进γδ T细胞依赖的细胞色素c的释放和下游casapse-9及caspase-3的活化（图2）。

表2 白藜芦醇增强γδ T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤活性（）

表2 白藜芦醇增强γδ T细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤活性（）

注：与对照组比较，*P<0.05；与γδ T细胞组比较，#P<0.05；与白藜芦醇组比较，&P<0.05；与γδ T细胞+白藜芦醇组比较，□P<0.05；LDH：乳酸脱氢酶

组别对照组γδ T细胞组白藜芦醇组γδ T细胞+白藜芦醇组γδ T细胞+白藜芦醇+c-FLIP质粒组孔数33333 LDH释放率（%）1.5±0.221.4±3.2* 4.4±0.568.2±7.1.9±3.6□

图2 白藜芦醇通过下调c-FLIP的表达促进γδ T细胞对MDA-MB-231凋亡的诱导

3 讨论

白藜芦醇是一种天然存在的多酚类药物，对多种疾病均有良好的治疗效果。近期研究表明，白藜芦醇还有一定的抗肿瘤效用，能抑制诸如结直肠癌和卵巢癌细胞的增殖和转移[7-8]。但是，白藜芦醇是否能增强乳腺癌免疫治疗的疗效至今还未有确切报道。本研究结果显示白藜芦醇能显著增强γδT细胞对MDA-MB-231乳腺癌细胞的杀伤活性，白藜芦醇是良好的免疫治疗辅助药物。

以往的研究表明c-FLIP是caspase-8的类似物，能竞争性地抑制caspase-8的功能却不具备caspase-8的生物活性，因此肿瘤细胞中的c-FLIP是caspase-8依赖的凋亡途径的抑制蛋白[9-10]。γδT细胞现已考虑作为一种免疫治疗药物进行临床试验，γδ T细胞主要通过分泌人凋亡相关因子配体（FasL）和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肿瘤细胞死亡。在γδT细胞诱导的细胞凋亡信号通路中，FasL和TRAIL首先使细胞中的caspase-8发生活化[5，11]。活化的caspase-8能诱导线粒体膜电位下降从而使细胞色素C等凋亡诱导物质从线粒体中释放到细胞质中，进而导致caspase-9和下游caspase-3的活化，最终引起凋亡的发生[12-13]。

本研究结果显示，白藜芦醇能显著下调乳腺癌细胞中c-FLIP这一caspase-8抑制蛋白[14]的表达水平。当用重组真核过表达质粒上调乳腺癌细胞中c-FLIP的蛋白水平后，白藜芦醇对γδT细胞的协同抗肿瘤作用受到明显抑制，证明白藜芦醇是通过降低乳腺癌中c-FLIP蛋白的表达增强γδT细胞依赖的凋亡信号，促使乳腺癌细胞发生caspase-8的活化，从而通过信号转导导致细胞发生凋亡性死亡。

综上所述，白藜芦醇能显著提高乳腺癌细胞对γδT细胞的敏感性，增强γδT细胞的抗肿瘤活性。这些研究为肿瘤免疫治疗提供了更有效的策略和思路。

［1］SiegelR，NaishadhamD，JemalA.Cancerstatistics，2013［J］. CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［2］Spellman A，TangSC.Immunotherapyforbreastcancer：past，present，and future［J］.Cancer Metastasis Rev，2016，35（4）：525-546.

［3］DokouhakiP，SchuhNW，ZhangL，etal.NKG2Dregu lates production of soluble TRAIL by ex vivo expanded human γδT cells［J］.Eur J Immunol，2013，43（12）：3175-3182.

［4］LiZ.PotentialofhumangammadeltaTcellsforim munotherapy of osteosarcoma［J］.Mol Biol Rep，2013，40（1）：427-437.

［5］LiZ，ZhangJ，WangR，etal.Celastrolincreasesosteosar coma cell lysis byγδT cells through up-regulation of death receptors［J］.Oncotarget，2016，7（51）：84388-84397.

［6］Gonnermann D，ObergHH，Wesch D，etal.Resistanceof cyclooxygenase-2 expressing pancreatic ductal adenocarcinoma cells againstγδT cell cytotoxicity［J］.Oncoimmunology，2015，4（3）.

［7］DuZ，ZhouF，HuangP，etal.Thehedgehog/Gli-1sig naling pathways is involved in the inhibitory effect of resveratrol on human colorectal cancer HCT116 cells［J］.Iran J Basic Med Sci，2016，19（11）：1171-1176.

［8］SeinoM，OkadaM，KitanakaC，etal.Differentialcontri bution of ROS to resveratrol-induced cell death and loss of selfrenewal capacity of ovarian cancer stem cells［J］.Anticancer Res，2015，35（1）：85-96.

［9］ZangF，WeiX，Sun B，etal.C-FLIP（L）contributesto TRAIL resistance in HER2-positive breast cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun，2014，450（1）：267-273.

［10］HuangY，YangX，ChangKJ，etal.Overcomingresis tance to TRAIL-induced apoptosis in solid tumor cells by simultaneously targeting death receptors c-FLIP and IAPs［J］.Int J Oncol，2016，49（1）：153-163.

［11］ZouC，ZhaoP，FuL，etal.γδT cel lsincancerim munotherapy［J］.Oncotarget，2017，8（5）：8900-8909.

［12］Huang G，Chen X，Xing C，et al.miR-20a-directed regulation of BID is associated with the RAIL sensitivity in colorectal cancer［J］.Oncol Rep，2017，37（1）：571-578.

［13］Laussmann MA，Passante E，Rehm M，et al.Proteasome inhibition can impair caspase-8 activation upon submaximal stimulation of apoptotic tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand（TRAIL）signaling［J］.J Biol Chem，2012，287（18）：14402-14411.

［14］Zhang YP，Kong QH，Chang KJ，et al.Inhibition of c-FLIP by RNAi enhances sensitivity of the human osteogenic sarcoma cell line U2OS to TRAIL-induced apoptosis［J］. Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（6）：2251-2256.

（收稿：2017-03-15修回：2017-05-12）

Effect and Mechanism of Resveratrol on Increasing the Sensitivity of Breast Cancer Cells to Cells

HUANG Lingyan Clinical Laboratory,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the effect of resveratrol on enhancing the cytotoxicity of cells to breast cancer and the underlying mechanism.Methods The cellswere amplified in vitroand cell population of was detected by flow cytometry.MDA-MB-231 cells were divided into control group,resveratrol group,cell group,resveratrol+cell group and resveratrol+cell+c-FLIP plasmid group.LDH release assays were performed to evaluate the cytotoxicity of cells to MDA-MB-231.Western blot analysis was performed to evaluate the expression of c-FLIP,activation of caspase 8,caspase 9,caspase 3,Bid and release of cytochrome c in MDA-MB-231 cells.Results Flow cytometry analysis showed that BrHPP and IL-2-cultrued peripheral blood mononuclear cells highly expressed CD3 and CR,thereby these cells were cells.Results of LDH release assays showed that the LDH release rate in cells+ resveratrol group（68.2±7.1）%was significantly higher than that in the cells group[（21.4±3.2）%,P<0.05]and cells+ resveratrol+c-FLIP plasmid group[（27.9±3.6）%,P<0.05].Results of western blot assays showed that resveratrol downregulated the expression of c-FLIP and that activation of caspase 8,caspase 9,caspase 3,Bid and release of cytochrome c was significantly higher than that in the cells group and cells+resveratrol+c-FLIP plasmid group. Conclusion Resveratrolincreased the sensitivity of breast cancer cells to cells through inhibition of c-FLIP expression.

breast cancer;MDA-MB-231 cells;cells;resveratrol;c-FLIP

book=650,ebook=18

浙江省立同德医院检验科（杭州310012）