S1P/S1P1信号通路在糖尿病心肌病大鼠心肌损伤中的作用与机制

莫海亮　姜佳美　刘畅

[摘要] 目的 探讨S1P/S1P1信号通路在糖尿病心肌病大鼠心肌损伤中的作用与机制。 方法 40只SD大鼠分为正常对照组和2型糖尿病心肌病，每组各20只，链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导老鼠建立2型DCM模型，STZ处理8周后，给予老鼠S1P1受体激动剂、S1P1受体拮抗剂干预，观察S1P1受体激动剂、S1P1受体拮抗剂对DCM心肌损伤的影响；HE染色检测心肌组织病理改变，免疫印迹法检测心肌组织Sphk1和S1P1的表达，ELISA法检测组织匀浆液S1P的表达，组织SphK1激酶活性定量检测试剂盒测定SphK1酶活性。 结果 与正常对照组比较，DCM组大鼠心脏凋亡增多、心肌肥大，同时SphK1及其产物S1P表达增加，S1P1受体下调，S1P1受体拮抗剂干预加重DCM心肌损伤，而S1P1受体激动剂能减轻心肌凋亡、心肌肥大、胶原沉积等。 结论 S1P/S1P1信号通路被抑制可能是DCM心肌损伤的机制之一，调控该通路可能是DCM心肌损伤的防治靶点。

[关键词] 鞘氨醇激酶-1；1-磷酸鞘氨醇；1-磷酸鞘氨醇受体1；糖尿病心肌病；凋亡

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）15-09-04

[Abstract] Objective To investigate the role and mechanism of S1P/S1P1 signaling pathway in cardiac injuries of diabetic cardiomyopathy （DCM） rats. Methods 40 SD rats were randomly divided into normal control group and diabetic cardiomyopathy （DCM） group with 20 cases in each.They were treated with normal saline and streptozotocin （STZ） respectively.After injection STZ for 8 weeks，diabetic rats were administrated with S1P1 receptor agonists or S1P1 receptor antagonists，and then these effects on cardiac injuries of DCM rats were explored.The pathological changes of myocardial tissue were detected by HE staining.Expressions of sphk1 and S1P1 in heart tissues were tested using Western blotting assay.S1P level in rat hearts tissue homogenate was tested using ELISA kit.SphK1 enzymic activity was measured by tissue SphK1 activity quantity kit. Results Compared with control group，cardiomyocyte apoptosis，left ventricular hypertrophy in diabetic rats were markedly elevated.Meanwhile，sphk1 expression and activity，and S1P1 expression in hearts tissue were upregulated，while S1P1 receptor was dramatically downregulated.However，S1P1 receptor antagonists could exacerbate cardiac injuries，and S1P1 receptor agonists could improve cardiac injuries. Conclusion S1P/S1P1 signaling pathway may contribute to the cardiac injuries of DCM rats，which will be regarded as therapeutic target.

[Key words] Sphingosine kinase；Sphingosine-1-phosphate；Sphingosine-1-phosphate receptor 1；Diabetic cardiomyopathy；Apoptosis

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）

作為糖尿病独立的并发症之一，其发病率高、危险性大，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题，尚无有效的治疗措施[1-2]。因此，深入阐明DCM的发病机制并寻找防治DCM的新靶标，从而在寻找及制定更有效的防治方案，已成为当前糖尿病学界和心血管病学界非常迫切的研究课题，且具有十分重要的理论意义与临床实用价值。近年来，越来越多证据表明，由鞘氨醇激酶（sphingosine kinase 1，SphK1）催化生成磷酸鞘氨醇（phingosine-1-phosphate，S1P），与S1P受体结合发挥功能在心血管疾病中的作用非常重要[3-4]。为此本研究首先观察STZ诱导的DCM大鼠心肌损伤及S1P/S1P1信号通路的变化，继而采用药物抑制剂干预探讨S1P/S1P1信号通路在DCM心肌细胞损伤中的作用及机制。本研究有助于深入阐明DCM心肌损伤机制以及为防治DCM心肌损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体重为（120±20）g的健康雄性SD大鼠40只（SPF级）由广东省医学实验动物中心提供。饲养于广东医学院实验动物中心（温度20℃～25℃，相对湿度40%～70%，空气洁净度10000级，落菌数≤3个/皿），換气频率为10～15次/h，所有动物均喂以标准饲料，自由饮水，饲养环境符合实验动物环境设施要求。

1.2 材料

链脲佐菌素、S1P1受体激动剂、S1P1受体拮抗剂购自Sigma-Aldrich公司；DMEM培养基购美国Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco BRL公司；Cell counter kit-8细胞计数试剂盒（CCK-8）购自日本Dojindo Lab公司；抗sphk1抗体和抗S1P1抗体购自Cell Signaling technology公司；组织SphK1激酶活性定量检测试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司；组织SIP的ELISA测定试剂盒购自上海前尘生物科技有限公司。

1.3 DCM大鼠模型建立

常规全价营养饲料（SPF级）适应性饲养一周后，随机分为正常饮食的对照组（10只）和高糖高脂饮食的高脂组（50只），分别饲养30天后，空腹16～18h，高脂组给予一次性腹腔注射STZ（30mg/kg），正常组给予同等剂量构機酸钢缓冲液腹腔注射。腹腔注射STZ一天后，大鼠出现多饮、多尿等糖尿病症状，再继续给予高糖高脂喂养1周后，使用ONE TOUCH测定血糖值，以72h后连续连续两次空腹血糖≥11.1mmol/L者，定义为糖尿病大鼠模型。另外，糖尿病组大鼠再根据是否给予药物干预分为模型对照组、S1P1受体激动剂组、S1P1受体拮抗剂组、吡格列酮组5mg/（kg·d），每组10只。药物干预自糖尿病建模成功后给予，灌胃给药6天，一直到实验结束，干预时间总计为8周。实验结束时禁食12h，禁食期间，大鼠保持正常的饮水，麻醉后，腹主动脉采血后迅速取出心脏，分别留取新鲜冰冻的组织和用固定液固定的组织用于检测相关指标，其中糖尿病模型组大鼠心肌组织形态学异常改变确认为DCM建模成功。

1.4 HE染色光镜检测心肌组织结构改变

将收集的各组大鼠心脏组织的相同部位于10%中性福尔马林液浸泡固定、脱水、石蜡包埋并切成4?m厚的切片，做HE染色，光镜下观察大鼠心肌组织结构变化和脂质沉积程度，透射电镜观察大鼠心肌细胞超微结构，每张切片观察10个视野。

1.5 Western blot法测定心肌Sphk1和S1P1蛋白的表达

留取部分心肌组织迅速装入冻存管放入液氮中速冻，后转移到 -80 ℃保存，供免疫印迹蛋白测定；将H9c2心肌细胞接种于6孔培养板中，培养至70%～80%时，各组给予不同的处理因素后，预冷的PBS洗涤细胞3次，滤干水分，每孔加入裂解液100?L，冰上裂解30min后，收集液体，12000r/min离心10min，取上清于-20℃保存，BCA检测总蛋白浓度。各组等质量蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳分离后，转移到PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉室温封闭非特异性条带2h，随后4℃孵育抗Sphk1抗体（1：1000）和抗S1P1抗体（1：1 000）过夜，然后用TBST洗涤3次，5min/次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室曝光到X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。重复5次。

1.6 统计学处理

使用SPSS19.0软件建立数据库和进行统计分析，计量资料采用（）表示，组间两两比较主要采用单因素方差分析（one-way ANOVA，LSD-t法）进行，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DCM大鼠心肌组织S1P/S1P1通路中S1P水平变化

为观察S1P/S1P1通路在糖尿病大鼠心脏损伤中的变化，采用ELISA试剂盒测定STZ诱导的糖尿病大鼠血浆与心肌组织S1P的水平。与正常对照组比较，DCM大鼠血浆与心肌组织S1P水平均显著升高（682.78±70.65）vs（973.17±168.90），差异有统计学意义（P<0.01）；（698.43±42.19）vs（2001.82±234.17），差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。

2.2 DCM大鼠心肌组织S1P/S1P1通路中SphK1表达和酶活性以及SIP表达变化

与正常对照组大鼠比较，DCM大鼠心肌组织SphK1酶活性明显升高（3.21±0.34）vs（8.16±1.78），差异有统计学意义（P<0.01），见图2。进一步采用Western blot assay检测蛋白表达，结果显示：与正常对照组大鼠比较，sphk1和SIP在DCM大鼠心肌组织的表达都显著上调（0.58±0.35）vs （1.19±0.42），差异有统计学意义（P<0.01）；（0.43±0.31）vs（0.95±0.40），差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 S1P/S1P1通路在DCM大鼠心肌损伤中的作用

为了探讨S1P/S1P1通路在DCM大鼠心肌损伤中的具体作用，采用S1P1受体激动剂、S1P1受体拮抗剂干预，观察对DCM心肌损伤的影响。与正常对照组大鼠比较，DCM组大鼠心肌组织可见心肌细胞肥大、心肌纤维化、心肌细胞灶性坏死、凋亡。S1P1受体激动剂组可减轻上述心肌组织病理损伤，S1P1受体拮抗剂组干预后可以明显加重糖尿病大鼠心肌组织损伤。见图3。

3 讨论

新近流行病学调查显示，预计2035年全球将有近5.92亿人患糖尿病，其中我国的糖尿病患病人数将达到1.43亿。糖尿病可引起多种并发症，对人体危害极大，而糖尿病心血管并发症是糖尿病患者的主要死因，其病死率是非糖尿病人群的2～3倍[5]。DCM是一种独立于高血压、冠心病、原发性心肌病，其病因和发病机制复杂，如内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）、脂毒性（lipotoxicity）、糖毒性（glucotoxicity）、氧化应激、心肌细胞凋亡、炎症反应和间质纤维化及微血管病变等均在其发病进程中起到非常重要的作用[6]。然而，DCM的分子机制和防御手段以及治疗手段还不是很令人满意[7]。

研究表明，磷酸鞘氨醇（phingosine-1-phosphate，S1P）是细胞膜鞘磷脂的代谢产物，由鞘氨醇激酶（sphingosine kinase 1，SphK 1）催化生成，具有促进细胞存活和抗凋亡作用[8]；S1P可以通过激活S1P受体发挥生物学作用，S1P受体包括S1P1、S1P2和S1P3三种，在心脏S1P主要通过S1P1受体激活ERK1/2、Akt等下游信号通路，增强细胞抗凋亡能力和细胞的迁移能力[9]；另方面，外源性 S1P或选择性S1P1受体激动剂（SEW2871）可以提高缺氧心肌细胞的存活率、对抗心肌细胞缺氧、缺血再灌注损伤[10]，对抗心肌细胞性损伤；在S1P受体基因敲除小鼠，冠状动脉结扎可以引起更为严重的心肌梗死[11]；这些研究证实，S1P/S1P1受体信号通路是促进心肌细胞存活和心脏保护的重要通路。而新近研究报道，糖尿病心脏S1P、S1P1受体表达显著下调，高糖损伤心肌细胞也可以引起S1P、S1P1受体表达降低，使用S1P1受体激动剂可以缓解糖尿病和高糖引起的心肌损伤[12-15]；这些研究与本研究结果均提示心肌细胞S1P/S1P1受体信号通路被抑制是DCM所致心肌损伤的一个关键因素，而通过对该通路的选择性干预或许能作为延缓DCM的进展，进而为DCM提供新的治疗措施。

以往研究证实，神经酰胺和S1P共同控制细胞的存活或凋亡。本研究结果显示，与正常对照组相比较，DCM大鼠心肌组织与血浆S1P的水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），原因与心肌组织SphK1酶的表达与活性升高密切相关；然而，糖尿病环境下与高糖刺激下心肌细胞损伤原因何在呢？S1P/S1P1信号通路究竟如何变化及其作用尚不清楚。为了明确S1P/S1P1通路在DCM大鼠心肌损伤中的具体作用，采用S1P1受体的激动剂和拮抗剂干预，观察对DCM心肌损伤的影响；结果显示，S1P1受体激动剂可减轻DCM心肌组织病理损伤，S1P1受体拮抗剂干预后却明显加重糖尿病大鼠心肌组织损伤。进一步验证了：S1P1受体表达降低引起S1P/S1P1通路缺陷介导了DCM大鼠心肌损伤，通过调控S1P/S1P1通路能防治了DCM大鼠心肌损伤。

综上所述，本研究首次验证了S1P/S1P1通路在DCM大鼠心肌损伤中的作用，并且探讨S1P/S1P1通路的调控是否可以作为防治DCM的靶标。因此本研究为进一步阐明DCM心肌损伤的分子机制及防治措施，具有重大的临床现实意义。

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（收稿日期：2017-03-05）