趋化因子CXCL12对卵巢癌细胞侵袭和转移的作用及机制研究

张庆悦

(喀什地区第一人民医院，新疆 喀什 844400)

趋化因子CXCL12对卵巢癌细胞侵袭和转移的作用及机制研究

张庆悦

(喀什地区第一人民医院，新疆 喀什 844400)

目的 研究趋化因子CXCL12对卵巢癌细胞侵袭和转移的作用及机制。方法 采用RT-PCR检测20例上皮性卵巢癌组织、卵巢癌细胞株CAOV3、血管内皮细胞株HUVEC和20例正常卵巢组织中CXCL12的mRNA表达及卵巢癌腹膜后淋巴组织和输卵管平滑肌组织中CXCL12的表达，ELISA法检测20例卵巢癌患者腹水中趋化因子CXCL12表达水平，比较不同浓度CXCL12对CAOV3及HUVEC细胞迁移能力及其表面相关黏附分子表达水平的影响。结果 20例卵巢癌组织、卵巢细胞CAOV3、内皮细胞HUVEC、转移的淋巴组织中CXCL12mRNA相对表达量分别为2.41±1.05、1.92±1.17、1.73±1.12、1.68±1.13，而正常组未检出，各组比较有显著性差异(F=2.907，P=0.032)。20例卵巢癌患者腹水中有19例检测到趋化因子CXCL12，检出率95.0%，CXCL12水平为(6 552.7±476.5)pg/mL。与对照组相比，CAOV3细胞经CXCL12处理后，与细胞外基质的粘附能力相对粘附率由(22.65±2.3)%上升至(51.47±2.7)%(t=4.696，P<0.05)。卵巢癌细胞株CAOV3与内皮细胞HUVEC中，加入CXCL12处理后，经Tramswell法检测，结果显示细胞数显著增加(t值分别为3.326、3.897、3.215、3.168，均P<0.05)，提示细胞的侵袭与迁移能力明显增强，其中浓度为100ng/mL的趋化活性最高，CAOV3 与HUVEC细胞趋化指数分别为4.0±1.5、4.3±1.7，对照组趋化指数分别为1.1±0.5、1.2±0.6，比较差异有统计学意义(t值分别为2.687、2.938，均P<0.05)。结论 趋化因子CXCL12通过调控卵巢癌细胞的黏附、侵袭和转移能力，进而提高CAOV3、HUVEC细胞活性，参与卵巢癌细胞的侵袭和转移。

卵巢癌；趋化因子；细胞侵袭；细胞转移；配体

卵巢癌是妇科常见女性生殖器官恶性肿瘤，发病率在妇科肿瘤中排第三位，但致死率排首位，治疗失败和致死率高的原因主要是癌细胞转移。癌细胞转移是一个复杂连续的过程，具有高度的组织性和器官选择性，虽然既往的研究证明有多种因素与癌细胞转移密切相关[1]，但其分子机制尚不清楚。趋化因子CXCL12(stromal cell derived factor-12，CXCL12)是趋化因子蛋白家族中的一种小分子细胞因子，对淋巴细胞有强烈的趋化作用。多数研究表明，CXCL12及其配体CXCR4与肿瘤发生、发展密切相关[2-3]，本研究旨在分析趋化因子CXCL12及其配体CXCR4对卵巢癌细胞侵袭和转移中的作用，并探讨卵巢癌腹腔转移的分子机制，以期为卵巢癌的治疗提供依据。

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1细胞株

卵巢癌细胞株CAOV3购自武汉大学医学宝藏中心，血管内皮细胞株HUVEC购自河北医科大学第四医院科研中心。

1.1.2临床样本

选取2015年6月至2016年6月喀什地区第一人民医院收治的20例卵巢癌患者，均经病理学检查证实为上皮性卵巢癌，年龄28～68岁，平均年龄(51.5±12.7)岁，包括浆液性癌13例，黏液性癌7例。对照组为同期收治的良性卵巢肿瘤患者20例，经病理学检查证实为良性卵巢肿瘤，年龄25～54岁，平均年龄(42.5±10.6)岁。

1.2方法

1.2.1样本采集

在患者手术时收集其卵巢癌组织、盆腔和腹膜后淋巴结组织及输卵管平滑肌组织，对照组为良性卵巢肿瘤患者切除的正常卵巢组织，将收集的样本均置于液氮中保存，同时收集卵巢癌患者腹水(注意不得有血液污染)，置于无菌的离心管中，-20℃保存待检。

1.2.2细胞培养

CAOV3和HUVEC细胞常规接种于RPMI-1640培养基中(含10%小牛血清、100μg/mL链霉素及100IU/mL青霉素)，然后置5%CO2培养箱中，湿度饱和，37℃下培养。根据细胞密度和生长情况传代。

1.2.3 RT-PCR检测卵巢癌细胞CXCL12mRNA表达水平

将收集到的肿瘤组织、输卵管平滑肌组织、转移的淋巴结组织及正常卵巢组织匀浆，加入CAOV3和HUVEC细胞，用TRlzol试剂提取组织中的总RNA，逆转录后用PCR扩增，同时扩增加内参照β-actin。扩增长度为227bp，CXCL12引物序列为，正义链：5’-CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3’。扩增反应条件：温度94℃，变性时间30s，55℃退火30s，70℃延伸30s，以上操作循环33次后，再70℃延伸10min后反应结束。

1.2.4卵巢癌腹水趋化因子CXCL12水平检测

采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定法检测卵巢癌患者腹水趋化因子CXCL12水平，操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.5细胞粘附试验

将RPMI1640培养基加入到96孔板中，每孔50μL，然后加20μL培养液，PBS冲洗后加入处理好细胞，每组同时设3个复孔，37℃孵育1h，PBS冲洗，每孔加0.04%结晶紫50μL染色，光镜(×200)下观察。每孔中加100μL10%冰乙酸，10min后用多功能酶标仪检测吸光度A值。

1.2.6细胞侵袭与迁移实验

首先将对数生长期的细胞接种于RPMI-1640培养基中培养24h，30μL细胞外基质胶涂Tramswell小室滤膜内表面，放超净台下干燥过夜，然后用含0.1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的RPMI-1640培养基水化，实验设置3组，第一组上室加10μL细胞悬液，下室加500μL含100ngCXCL12的完全培养基，第二组在第一组的基础上加CXCL12封闭单克隆抗体20μL，第三组为空白对照组。置5%CO2培养箱中37℃下孵育16h。使用带膜的小室制片。每组设3个平行滤膜，每膜随机取5个视野。细胞迁移实验同侵袭实验，区别在于滤膜内表面不加细胞外基质胶。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0进行数据处理，两个样本之间均数比较采用t检验或方差分析，以P<0.05为有统计学差异。

2结果

2.1 RT-PCR检测CXCL12mRNA表达水平

20例卵巢癌组织、卵巢细胞CAOV3、内皮细胞HUVEC、转移的淋巴组织中，CXCL12mRNA相对表达量分别为2.41±1.05、1.92±1.17、1.73±1.12、1.68±1.13，而在正常组中未检出，各组比较有显著性差异(F=2.907，P=0.032)，电泳见图1。

注：M：100bpMarker，1：正常卵巢组织，2：卵巢癌组织，3：CAOV3，4：HUVEC，5：淋巴组织。

图1 CXCL12表达电泳图

Fig. 1 Expression electrophoregram of CXCL12

2.2卵巢癌腹水趋化因子CXCL12水平

在20例卵巢癌患者腹水中，有19例检测到趋化因子CXCL12，检出率95.0%，CXCL12水平为(6 552.7±476.5)pg/mL。

2.3细胞外基质与肿瘤细胞的粘附能力

与对照组相比，CAOV3细胞经CXCL12处理后，与细胞外基质的黏附能力相对黏附率由(22.65±2.3)%上升至(51.47±2.7%)(t=4.696，P<0.05)，见图2。

注：A:对照组，B：经CXCL12处理后CAOV3细胞。

图2 细胞黏附试验

Fig. 2 Cell adhesion test

2.4趋化因子CXCL12可提高癌细胞的侵袭、迁移能力

卵巢癌细胞株CAOV3与内皮细胞HUVEC中，加入CXCL12处理后，经Tramswell法检测，结果显示细胞数均显著增加(t值分别为3.326、3.897、3.215、3.168，均P<0.05)，提示细胞的侵袭与迁移能力明显增强，见图3和图4，其中浓度为100ng/mL的趋化活性最高，CAOV3 与HUVEC细胞趋化指数分别为4.0±1.5、4.3±1.7，对照组趋化指数分别为1.1±0.5、1.2±0.6，比较差异有统计学意义(t值分别为2.687、2.938，均P<0.05)。

图3 趋化因子CXCL12对卵巢癌细胞的迁移的影响

Fig. 3 Influence of chemokines CXCL12 on migration of ovarian cancer cells

图4 趋化因子CXCL12对卵巢癌细胞的侵袭的影响

Fig. 4 Influence of chemokines CXCL12 on invasion of ovarian cancer cells

3讨论

3.1趋化因子CXCL12在癌症转移中的作用

癌细胞转移是卵巢癌治疗失败和死亡率高的主要原因，也是恶性肿瘤重要的临床特征，如何有效控制癌细胞转移是治疗的关键，对患者的预后也十分关键。癌细胞转移过程是复杂的，受多种因素的影响，不仅与癌细胞本身有关，也与癌细胞所处微环境及信号通道的变化密切相关，因此，控制癌细胞转移是提高患者生存期的关键。近年来的研究表明，趋化因子CXCL12在肿瘤的侵袭、转化等过程中起重要作用，CXCL12与其受体CXCR4结合后，参与细胞的生长、分化、凋亡肿瘤的转移等多种生理病理的过程，具有广泛的生物学作用[4-5]，逐渐成为研究的热点。

趋化因子是蛋白家族中的一种具有化学趋化性的细胞因子，分为四大类：CXC、CC、C和CX3C，多数癌细胞表达CXC和CC，卵巢癌腹水癌细胞表达CXCR4，同时也有CXCL12。Miwa等[6]研究证实，CXCL12/ CXCR4与卵巢上皮癌转移有关，并且有超过80%的卵巢癌组织中有CXCL12的表达，在95%卵巢癌患者腹水中检测到CXCL12。本研究共对20例卵巢癌患者腹水进行CXCL12水平检测，其中有95.0%的患者中检测CXCL12，与既往研究结果一致。Yang等[7]研究发现，正常卵巢上皮细胞中没有CXCL12表达，而卵巢癌组织中高表达，本研究也发现癌组织、卵巢细胞CAOV3、内皮细胞HUVEC、转移的淋巴组织中CXCL12mRNA相对表达量分别为2.41±1.05、1.92±1.17、1.73±1.12、1.68±1.13，而正常组未检出，各组比较有显著性差异(P=0.032)。癌性腹水和重组CXCL12均可诱导卵巢癌细胞迁移，CXCL12与其受体作用后，诱发细胞定向性侵袭、迁移和血管生成，作用过程与癌细胞侵袭机制一致。

3.2趋化因子CXCL12在癌细胞的侵袭、迁移能力中的作用

血管生成的增加是恶性肿瘤病情进展的一个重要标志，CXCL12可直接刺激肿瘤原发灶内及其外周组织中新生血管生成。此外CXCL12还能促进肿瘤细胞增殖，并通过其间接抵抗调亡的作用来促进肿瘤细胞的生长发育[8]。本研究结果显示，卵巢癌细胞株CAOV3与内皮细胞HUVEC中，加入CXCL12处理后，经Tramswell法检测，结果显示细胞数显著增加(P<0.05)，提示细胞的侵袭与迁移能力明显增强，其中浓度为100ng/mL的趋化活性最高，CAOV3 与HUVEC细胞趋化指数分别为4.0±1.5、4.3±1.7，对照组趋化指数分别为1.1±0.5、1.2±0.6，比较差异有统计学意义(P<0.05)。趋化因子CXCL12调节肿瘤细胞的黏附能力主要通过改变肿瘤细胞及其外基质、基底膜的粘附能力，进而促使肿瘤细胞更易于向外迁徙[9]。本研究发现，与对照组相比，CAOV3细胞经CXCL12处理后，与细胞外基质的粘附能力相对黏附率由22.65±2.3%上升至51.47±2.7%(P<0.05)，以上结果进一步表明CXCL12 与卵巢癌的侵袭、迁移密切相关。

综上所述，趋化因子CXCL12与卵巢癌细胞侵袭、迁移密切相关，作用机制可能是通过调控卵巢癌细胞的粘附能力、促进肿瘤细胞增殖，提高CAOV3、HUVEC细胞活性，参与卵巢癌细胞的侵袭和转移。

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[专业责任编辑：杨文方]

EffectofchemokineCXCL12oninvasionandmetastasisofovariancancercellsanditsmechanism

ZHAGNQing-yue

(FirstPeople’sHospitalofKashgar,XinjiangKashgar844400,China)

Objective To study the effect of chemokine stromal cell derived factor-12 (CXCL12) on invasion and metastasis of ovarian cancer cells and its mechanism. Methods Expression of mRNA of CXCL12 in 20 cases of epithelial ovarian cancer tissue, ovarian cancer cell line CAOV3, vascular endothelial cell line HUVEC and 20 normal ovarian tissues and expression of CXCL12 in ovarian cancer retroperitoneal lymphoid tissue and oviduct smooth muscle tissue were detected by RT-PCR. Levels of chemokine CXCL12 in ascites of 20 patients with ovarian cancer were detected by ELISA. Effects of different concentrations of CXCL12 on migration ability of CAOV3 and HUVEC cells and the expression of surface-related adhesion molecules were compared. Results CXCL12 mRNA relative expression amount in 20 cases of ovarian cancer tissue, ovarian cells CAOV3, endothelial cells HUVEC and invaded lymph tissues was 2.41±1.05, 1.92±1.17, 1.73±1.12 and 1.68±1.13, respectively, which was not found in normal group, and difference between groups was significant (F=2.907,P=0.032). Chemokine CXCL12 was detected in ascites of 19 cases in 20 cases of ovarian cancer, with detection rate of 95.0%, and CXCL12 level was 6 552.7±476.5pg/mL. Compared with control group, relative adhesion rate of CAOV3 cells processed by CXCL12 increased to 51.47±2.7% from 22.65±2.3% (t=4.696,P<0.05). After ovarian cancer cell lines CAOV3 and endothelial cells HUVEC were processed with CXCL2, significant increase in cell number was detected by Tramswell method (tvalue was 3.326, 3.897, 3.215 and 3.168, respectively, allP<0.05), indicating significant increase in cell invasion and migration ability. Chemotactic activity under concentration of 100ng/mL was highest. Cell chemotactic index of CAOV3 and HUVEC was 4.0±1.5 and 4.3±1.7, respectively, which was 1.1±0.5 and 1.2±0.6, respectively in control group, and difference was statistically significant (tvalue was 2.687 and 2.938, respectively, bothP<0.05).Conclusion Through regulating adhesion, invasion and migration ability of ovarian cancer cells and increasing activity of CAOV3 and HUVEC cells, chemokine CXCL12 participates in the invasion and metastasis of ovarian cancer cells.

ovarian cancer; chemokine; cell invasion; cell metastasis; ligand

2017-06-21

张庆悦(1971-)，女，副主任医师，主要从事妇科肿瘤研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.07.013

R771.7

[文章编号]1673-5293(2017)07-0790-03