ABO疑难血型鉴定中应用PCR—SSP法的探讨

钟胜英

[摘要]目的 对ABO疑难血型鉴定中应用PCR-SSP法的临床价值进行探讨。方法 选取2015年1月～2016年12月我院收治的225例ABO疑难血型受试者，分别给予PCR-SSP法和血清学定型方法进行检测，对比相关数据差异。结果 PCR-SSP法与血清学定型方法的检测结果比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中临床应用价值高，值得临床输血工作者关注。

[关键词]ABO血型；血清学定型；聚合酶链反应-序列特异性引物法

[中图分类号] R457.11 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（c）-0113-03

Application of PCR-SSP method in the identification of suspicious ABO blood group

ZHONG Sheng-ying

Department of Blood Transfusion，Xingning People′s Hospital of Guangdong Province，Xingning 514500，China

[Abstract]Objective To explore the clinical value of PCR-SSP in the identification of suspicious ABO blood group.Methods 225 cases of suspicious ABO blood type subjects admitted by our hospital from January 2015 to December 2016 were selected and respectively tested by the PCR-SSP and serological typing methods.The relevant data differences were compared.Results The results of PCR-SSP and serological typing methods were compared and the differences were statistically significant （P<0.05）.Conclusion The PCR-SSP method has high clinical value in the identification of suspicious ABO blood group and it is worth the attention of clinical transfusion workers.

[Key words]ABO blood group；Serological typing；PCR-SSP

早在1900年ABO血型系統对于临床输血治疗过程中所具有的重要指导意义就已经被发现，并得到广泛性的认可。ABO血型的标准血清学正反定型方法，在实际应用过程中由于其具有操作方法、简单、实用的特点，在临床上被广泛应用。但是，需要注意的是，血清学试验的局限性已经被发现，它受生理学、病理学等诸多因素影响的可能性较大，使正反定型不符情况发生[1]。近几年经大量研究与实践证实，基因分型手段，在某一程度上能够充分地克服血清学试验在实际应用中所具有的上述弱点，其作为血清学补充方法之一，为临床输血治疗、亲子鉴定、个体识别提供了依据[2]。本次研究中，笔者以225例ABO疑难血型受试者作为考察对象，分析探讨ABO疑难血型鉴定中应用聚合酶链反应-序列特异性引物法（PCR-SSP）的临床价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2015年1月～2016年12月我院收治的225例ABO疑难血型受试者作为研究对象，其中男性117例，女性108例；年龄6个月～78岁，平均（45.6±10.3）岁；均符合ABO疑难血型受试者诊断标准；研究经我院医学伦理委员会审核及同意；本人或家属均知晓本研究情况并签署同意书；排除存在血液系统疾病者，依从性较差者，罹患系统性疾病者。

1.2研究方法

血清学：筛选红细胞、抗A、抗B标准血清、ABO试剂红细胞、谱细胞均由上海市血液中心提供。抗体筛选以及抗体鉴定采取间接抗人球法，ABO血型鉴定经试管法盐水正反定型。

DNA经盐酸胍提取。盐酸胍溶液可以对细胞产生一定的裂解作用，使蛋白质在短时间内发生变性，使DNA与硅胶模之间的结合速度加快，经过清洗、洗脱等处理之后，可以最终获得相应的DNA。

采用PCR-SSP法检测，PCR反应体系10 μl，其中0.1 μl Taq酶（5 U/μl），0.9 μl DNA（30 ng/μl），9 μl dNTP-Buffer工作液。PCR扩增，选择美国PE9700型PCR扩增仪，扩增的基本条件设定为：96℃ 2 min；96℃ 20 s，68℃ 60 s，循环5次；96℃ 20 s，65℃ 45 s，72℃ 30 s，循环10次；96℃ 20 s，62℃ 45 s，72℃ 30 s，循环15次；72℃ 3 min；4℃条件下进行保存。PCR扩增产物检测：将PCR反应产物转移至2.5%琼脂榶凝胶孔中，在140～150 V的条件下，实施电泳处理，处理时间控制在15～20 min，观察结构，判断有无特异性条带，与结果分型表进行比对之后得出具体的血型检测结果。

1.3观察指标

观察对比经PCR-SSP法与血清学定型方法检测出的结果差异。

1.4统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对两种方法血清学定型检测结果差异进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

采用血清学方法，定型结果为A型的受试者63例；采用PCR-SSP法，受试者的具体基因型结果为：A1O1型42例，A1O2型48例，A2O1型12例，A2O1型15例，A1A2型6例，A1A1型3例。两种方法比较，差异有统计学意义（χ2=13.021，P=0.000）；采用血清学方法，定型结果为B型的受试者66例；采用PCR-SSP法，受试者的具体基因型结果为：BO1型15例，BO2型21例，BB型9例。两种方法比较，差异有统计学意义（χ2=7.854，P=0.002）；采用血清学方法，定型结果为O型的受试者12例；采用PCR-SSP法，受试者的具体基因型结果为：O1O1型3例，O1O2型0例。两种方法比较，差异有统计学意义（χ2=4.672，P=0.043）。采用血清学方法，定型结果为AB型的受试者84例；采用PCR-SSP法，受试者的具体基因型结果为：A1B型27例，A2B型24例。两种方法比较，差异有统计学意义（χ2=11.304，P=0.000）。

3讨论

输血前标本采集的正确性、规范化操作是保证ABO血型鉴定结果准确性、输血安全有效的根本保证。血液标本会受到生理、病理、采集、治疗等诸多因素的影响，进而造成ABO血型鉴定出现困难[3]。

ABO疑难血型多表现出以下几点：①正定型与反定型结果不符；②弱凝集，+/-判断困难；③血型“改变”，两次定型的结果不符；④与ABO“同型血”，交叉配血不匹配；⑤与ABO“同型血”交叉配血“相合”，在输血过程中却发生了输血反应；⑥与ABO“同型血”交叉配血相合，在输血过程中无反应，但是Hb升高值并未达到预期效果[4-7]。曾有学者指出，针对疑难血型标本，进一步展开不规则抗体筛查、吸收放散、唾液血型物质凝集抑制试验的意义重大，经上述手段多可以对抗-M、抗-P1以及非特异性冷凝集等意外抗体产生ABO血型鉴定困难等诸多问题[8-9]。遇到特殊情况，譬如说红细胞被自身抗体致敏、ABO亚型、表型被疾病等因素干扰等在应用血清学方法的检测血型结果出现困难时，开展分子生物学基因分型检测，能夠对血型判断提供可靠的参考依据，为一项不可或缺的辅助手段，目前已经引起人们的重视。近期有学者指出，对ABO疑难血型进行鉴定的过程中，在传统血清学鉴定技术基础上，与ABO基因分型检测技术相结合，可以快速、简便、准确地对疑难ABO血型进行鉴定，并且不会受到自身抗体的干扰，不需要重复采取，无家系调查必要，可不考虑是否是分泌型，能够顺利解决疑难血型鉴定等问题，对传统血清学鉴定技术的缺陷有弥补作用，值得关注[10-12]。

相关领域近年来所进行的研究结果证实，采用血清学方法对ABO血型进行鉴定的过程中，主要利用血型抗原和抗体，针对实际工作中所遇到的一些疑难的血型鉴定者，可以根据实际情况适当地增加进行吸收放散试验、唾液定型检测等，抗原、抗体在不同亚型或一些疾病中，通常情况下会表现出一定的强化状态，使血型判断的难度增加，使结果判断具有较大主观性，且鉴定结果还有可能受到试剂质量的影响。经研究与实践证实，DNA不会受到以上因素的影响，实验显示，ABO基因座位由7个外显子组成，其中第4、7外显子编码的氨基酸序列对A、B转移酶特异性产生了决定性作用，目前为止，已经发现的ABO亚型基因序列达到30种以上，具有序列多态性的等位基因构成了ABO血型分子生物学分型的基础[13-15]。

曾有文献报道，造成ABO血型鉴定不相符的影响因素包括：①血型鉴定技术因素。定性试剂血清失效，或者是红细胞悬液、试剂血清、盐水被细菌污染，或者是加血标本的过程中发生交叉污染，技术人员并没有严格的按照操作规程展开相应试验，如：试管中未加入定型试剂血清，加错血标本；患者红细胞悬液浓度过低；离心操作时间过短；没有进行反定型，仅通过肉眼对结果进行观察；在血型抗原性减弱的情况下，微弱细小凝集并未被发现；试管没有进行标记，在离心完成后，试管拿错，造成张冠李戴现象的发生；没有正确对血型鉴定结果进行解释和记录，将ABO定型试剂血清的“抗A或者是抗B血清”被误认为是A型或者是B型血清，并未认识到在试验过程中，溶血现象同样是阳性反应，进而造成结果判断失误。②患者血清或者是红细胞因素。血型抗体减弱或缺乏会造成ABO血型正反定型不符情况，如：老年人群的血清抗体效价相对较低，新生儿的血清中ABO抗体一般呈现为阴性或者是很弱，因此，多不会对婴儿展开ABO反定型。对于白血病患者而言，其多合并低病种球蛋白血症，淋巴瘤患者会合并出现低丙种球蛋白血症，免疫抑制剂的应用会造成低丙种球蛋白血症的出现，一些免疫缺陷患者，血清中ABO抗体与红细胞抗原不一致，因此会对血型鉴定结果产生影响。曾有研究指出，红细胞抗原性减弱或者是缺乏会造成ABO血型正反定型不符情况发生，譬如说A或者是B亚型。白血病患者以及一些恶性肿瘤患者的红细胞A或者是B抗原性减弱[16]。

采用PCR-SSP技术对ABO血型的具体基因型情况进行监测，主要是利用ABO基因中所存在的突变位点上，所携带的核苷酸具有一定的差异性，设计一序列具有较强特异性的引物，对ABO血型基因的DNA片段进行直接的扩增处理，对ABO血型以及亚型进行检测。本次研究发现，相对于血清学方法，PCR-SSP能够使血清学鉴定只能鉴定表现型的局限性得到克服，研究结果提示，PCR-SSP法与血清学定型方法的检测结果比较，差异有统计学意义（P<0.05），这一结果与相关文献[17-18]报道结果相似。

综上所述，PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中的应用价值较高，在临床输血工作中可对其给予广泛应用，不仅能够明确ABO血型，还能准确诊断A1O1、A1O2、A2O1、A2O2、A1A2、A1A1、BO1、BO2、BB、O1O1、 O1O2、A1B、A2B等分布情况，经基因检验均可以对血型进行确定，同型输血效果较为理想。

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（收稿日期：2017-05-11 本文编辑：任 念）