组织工程修复软骨缺损的研究进展

张治金++曾林如++朱芳兵++郭林

[摘要] 关节软骨缺损所带来的疼痛及关节活动障碍严重影响了患者的生活质量，组织工程技术应用于软骨缺损的修复成为研究的热点，为其治疗提供了新的思路。本文就种子细胞的要求、来源以及培养方法，生物支架的要求及类型，细胞生长调节因子进行综述，总结组织工程修复软骨缺损的研究进展。

[关键词] 软骨缺损；组织工程；种子细胞；支架；细胞因子

[中图分类号] R681.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（b）-0036-05

Study progress of tissue-engineered cartilage in repairing cartilage defect

ZHANG Zhijin1 ZENG Linru2 ZHU Fangbing3 GUO Lin4

1.Eleven Ward Two Department of Hand Surgery， Xiaoshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou City， Zhejiang Province， Hangzhou 311201， China； 2.Department of Ankle Surgery， Xiaoshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou City， Zhejiang Province， Hangzhou 311201， China； 3.Department of Sports Medicine， Xiaoshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou City， Zhejiang Province， Hangzhou 311201， China； 4.Department of Joint Surgery， Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116001， China

[Abstract] The pain and joint movement disorder caused by articular cartilage defects have seriously affected the quality of life of patients. The application of tissue engineering technology in the repair of cartilage defects has become a hot topic in research， which provides a new idea for its treatment. In this paper， we review the research progress of tissue engineering to repair cartilage defects on the basis of the requirements， sources and methods of seed cells， the requirements and types of biological scaffold， and the regulation of cell growth factors.

[Key words] Cartilage defect； Tissue engineering； Seeding cells； Support； Cytokines

关节软骨缺损为常见的骨关节病之一，临床上主要表现为顽固性疼痛、关节活动障碍，甚者可丧失关节功能，是引起肢体功能丧失和降低生活质量的主要原因之一。国外有学者统计关节软骨损伤的发病率可达5%，从事特殊职业发生率可达22%～50%[1-2]。软骨在关节活动中占据重要的作用[3]，但其自身修复能力非常有限。研究表明，直径< 3 mm的软骨缺损有可能部分或全部修复，直径> 4 mm则不能自行修复[4]。传统的软骨修复术虽然能在一定程度上缓解症状，但仍存在缺陷，研究发现修复后的组织在组成、结构和力学特性上与正常软骨存在明显的区别[5]。组织工程学致力于发展新生代材料用以修复、替代、提高人体器官和功能[6]。组织工程技术的兴起无疑为软骨缺损的修复提供新的思路，其重点在于种子细胞、可降解的支架材料以及细胞生长调节因子的三维空间复合体，本文就组织工程技术修复软骨缺损的研究进展进行综述。

1 种子细胞

1.1 种子细胞的要求

理想的软骨细胞种子细胞源要求具备：①取材方便，对机体的创伤较小；②体外扩增培养时增殖力强；③稳定的软骨细胞表型可得以维持；④植入人体内免疫排斥反应小，生物安全性高；⑤黏附支架材料力强；⑥在植入受体内能对缺损软骨有效修复，且有明确的远期疗效[7]。

1.2 种子细胞的来源

1.2.1 软骨细胞 软骨细胞是组织工程技术应用于软骨修复中最早的一类种子细胞，其为终末分化细胞，且具有取材方便以及免疫排斥反应小的优点，是软骨组织种子细胞的重要来源。自体软骨细胞不存在免疫排斥反应，且通过自身取得软骨組织后可通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶获得纯度较高的软骨细胞。研究证明，来自体外的机械应力可促进软骨细胞的分化、增殖以及增加细胞外基质的产生[8-10]。张仲文等[11]研究发现，自体软骨细胞在10例膝关节软骨缺损的患者修复中有效、安全，且在新形成的软骨组织中为透明软骨和纤维软骨的混合体，以透明软骨为主。但自体软骨细胞存在不足：①三代以后的自体软骨细胞出现生长缓慢、去分化、细胞表型改变等老化现象；②软骨细胞会随着供体年龄的增加活性下降；③自体软骨细胞的来源局限，增殖率低，同时造成供应区疼痛及增加骨关节炎的发病率。

1.2.2 间充质干细胞 间充质干细胞的组织来源丰富，且增殖能力强。不同的间充质干细胞不会因为其来源不同而影响其多向分化的能力[12]。来自骨髓源的间充质干细胞可取自肋骨、髂骨、骨干，获取方法简单便行[13]；且具有多向分化潜能和高度自我更新的前体细胞[14-15]，因此骨髓间充质干细胞被认为是组织工程修复软骨缺损的理想种子细胞来源[16]。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）已被证明自体移植不具有免疫排斥性，为安全的种子细胞源[17]。研究显示，取犬骨髓分离培养BMSCs，并在软骨细胞诱导液培养下，6周后可见软骨陷窝，说明成熟软骨细胞形成[18]。但BMSCs同样具有缺陷：①分化成软骨细胞所需的诱导条件较高；②重度骨关节炎患者BMSCs的成软骨能力明显减弱[19]；③BMSCs传代至90代后可发生癌变。孙鹏浩[20]研究发现，BMSCs与软骨细胞在体外长期培养下，其原癌细胞表达为阳性。脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）对供体损伤较小，且黏附及增殖能力仅与自体体制有关，是比较理想的种子细胞源[21]。且其不具有免疫抑制性，不易受到肿瘤细胞的污染，易于实现体外净化。Winter等[22]通过实验研究发现，BMSCs分化成软骨细胞的能力弱于ADSCs，其证明BMSCs是软骨组织工程中分化成软骨能力最强的细胞。

1.2.3 胚胎干细胞 胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）具有良好的组织分化潜能以及高增殖活性，展现了良好的应用前景。Wakitani等[23]将ESCs移植到免疫抑制的关节软骨缺损模型小鼠时，软骨组织修复良好。Kramer等[24]研究认为，胚胎干细胞在体外自发分化成软骨细胞的能力明显优于骨髓干细胞。但存在胚胎干细胞来源困难、可能形成畸胎瘤、遗传不稳定、培养过程中染色体异常等问题亟待解决。

1.3 种子细胞的培养方法

传统的单层培养方式易发生去分化，仅用于软骨细胞的初步培养。三维立体的培养体系尤为重要，静止的三维培养体系为种子细胞提供根据软骨缺损不规则形状制成的三维支架，有利于保持相互间的通信和接触以及获得充足的营养物质。但可能存在种子细胞分布不均或者无法形成类似于体内动态环境[25]。而生物反应器营造类似集体的微环境，提供了一定的力学刺激，模拟机体微环境，使营养物质的给予更加合理和充分，同时促进软骨细胞的增殖、分化以及基质合成，在形成软骨上具有优势。

2 支架材料

2.1 支架材料的要求

生物支架日渐趋于向复合性和功能性的方向发展，理想的支架材料应具有综合性能。①材料：生物降解性和与组织生长率相适合的降解率；②结构：具有三维立体结构，80%孔隙率；③相容性：支架应与周围组织无免疫原性；④细胞界面：良好的表面活性，适宜黏附，可提供良好的微环境；⑤可塑性：支架的结构可塑，且维持不变。

2.2 支架材料的来源

2.2.1 天然生物大分子蛋白 天然生物大分子蛋白的支架材料不但具有关节软骨再生的理化特性，且具有良好的组织相容性、低细胞毒性、弱免疫原性以及自身可降解性，促进细胞的黏附、增殖以及分化等生物特性。但也因为易降解，常致提前坍塌生成不了新组织的不足。主要支架为：①胶原蛋白因其来源广、低免疫原性、良好的生物相容性和安全性，可降解吸收以及便于加工成多种形状在临床上广泛应用，但其存在缺乏机械强度难以用于软骨缺损修复以及降解速率过快，且高纯度的胶原获取成本高等不足；Lee等[26]研究组织工程培育软骨细胞时，选用Ⅱ型胶原作为生物支架培养种子细胞，发现在Ⅱ型胶原作为支架上增殖的软骨细胞生长和功能情况均良好。②纤维蛋白来源广泛，具有很好的生物相容性，不存在免疫排斥，且在凝血酶的作用下可塑、可黏附、可降解；然而其易发生急剧萎缩、退化以及机械强度较低；研究发现在自体骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨的研究中，复合富血小板纤维蛋白的支架可促进软骨修复[27-28]。③壳聚糖因其良好的生物相容性、可降解性以及成型性等优势[29]为重要的支架材料之一；林涛等[30]选用壳聚糖水凝胶作为支架，结果关节软骨以一种完全结构性的形式得以良好修复。④天然脱细胞基质因其为自体或异种的组织或器官去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，得到的天然基质材料；杨自权等[31]利用牛关节软骨脱细胞处理，制成既保留软骨基质主要成分，又具备良好生物相容性和理化性质的多孔状新型载体材料。

2.2.2 人工合成高分子聚合材料 人工合成高分子聚合材料大多采用仿生学理念[32-33]，合成替代细胞外基质的高分子材料，其主要优点为来源广泛，可塑性强，能较好地诱导、促进软骨细胞的黏附、增殖和分化，但仍存在亲水性差，吸附力弱；降解产物不利于细胞生长以及具有一定免疫原性等不足。聚羟基乙酸（PGA）具有良好的组织相容性，其不足在于易降解，导致支架塌陷，其降解产物羟基酸可导致局部的pH偏小。陈哲峰等[34]研究使用PGA作为生物支架的材料，软骨细胞易黏附，且可长时间的保持软骨生物特性。聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物组织相容性良好，可降解。Vacanti等[35]最早利用PGA、PLA作为支架材料，可培养出软骨细胞。但存在细胞不易黏附、降解率低、成本高等不足。

2.2.3 复合材料 复合材料是在两种或两种以上的不同材料上改性或进行仿生学处理后，扬长避短，形成优良特性的新材料。刘建斌[36]将壳聚糖-明胶/β-磷酸三钙复合体作为组织工程软骨支架材料进行研究，发现其具有良好的超微结构、机械性能和生物相容性。另外纳米材料因其较好的靶性和一定的延展性，在组织工程化支架结构的研究及运用中得到了重视[37]。

3 细胞生长调节因子

软骨定向诱导分化需要适合的刺激因子刺激和推动软骨的分化，现已证明诸多细胞因子均可诱导或刺激软骨细胞分化。TGF-β是目前诱导因子中研究最多且疗效最好的因子之一[38-39]，对软骨细胞的生长分化具有重要的作用。同志超等[40]用TGF-β2作为软骨诱导的主要诱导剂，定向分化软骨细胞，可见Ⅱ型胶原软骨陷窝形成。IGF-1具有胰島素样生物活性，又依赖生长激素，可调控软骨细胞合成基质，增加软骨蛋白，抑制正常细胞外基质降解，从而调节软骨基质的合成和降解平衡[41]。付勤等[42]研究发现单层培养的条件下，外源性转化生长因子TGF-β1和IGF-1可促进脂肪间充质干细胞可促进软骨细胞定向分化，但TGF-β1的诱导效果要比IGF-1明显，且两种同时应用时具有协同作用。FGF主要以碱性成纤维生长因子（FGF2）和酸性成纤维生长因子（cFGF1）的形式存在，可刺激软骨细胞的增殖和分化。BMPs是一类酸性糖蛋白，现有研究证明BMPs作为生物活性因子可以诱导间充质干细胞分化成软骨细胞[43-44]。

4 总结和展望

软骨组织工程是现代医学界的前沿科学，利用组织工程技术修复软骨缺损取得较大的成功[45]。安全高效的种子细胞源是这一技术的基础和关键，但现有的种子细胞中尚未发现一种细胞完全符合组织工程修复软骨缺损的要求。软骨细胞免疫原性低，但存在三代以后去分化等的风险，BMSCs相对于ADSCs和脐带间充质干细胞更具有分化成软骨细胞的潜能，但是其安全性待进一步研究，其长期体外培养可能存在癌变风险。胚胎干细胞虽然具有高度未分化的生物特性，但是其安全问题同样需要进一步研究。一个能与种子细胞产生理想和可控相互作用的支架是组织生物工程得以实施的重要环节，复合材料组成的三维支架满足组织工程的需要。随着生物材料学的发展，新型的支架材料投入组织工程研究中，仿生材料、改性及修饰材料将成为支架材料的热点研究方向。细胞生长因子在软骨细胞的定向分化中起着重要的作用。随着软骨定向分化因子研究的深入，新的细胞因子不断被用于调控诱导种子细胞向软骨方向转化。组织工程修复软骨缺损在临床上的应用还存在诸多问题，必须遵循安全、有效及操作简便的原则。种子细胞筛选、获取以及进行体外培养问题，以及针对种子细胞的优化和安全问题；三维支架材料的仿生、改性及修饰问题；以及细胞生长因子的联合和续贯使用问题，都是组织工程修复软骨缺损的研究与临床应用亟待解决的问题。相信组织工程技术为软骨缺损的修复提供新的治疗方式，同时也将促进组织工程的进一步发展。

[参考文献]

[1] Sittinger M，Bujia J，Rotter N，et al. Tissue engineering and autologous transplant formation：practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques [J]. Biomaterials，1996，17（3）：237.

[2] Marijnissen WJ，van Osch GJ，Aigner J，et al. Alginate as a chondrocyte-delivery substance in combination with a non-woven scaffold for cartilage tissue engineering [J]. Biomaterials，2002，23（6）：1511.

[3] Gobbi A，Nunag P，Malinowski K. Treatment of full thickness chondral lesions of the knee with microfracture in a group of athletes [J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2005，13（3）：213-221.

[4] Widuchowski W，Widuchowski J，Trzaska T. Articular cartilage defects：study of 25，124 knee arthroscopies [J]. Knee，2007，14（3）：177-182.

[5] Gross AE，Agnidis Z，Hutchison CR. Osteochondral defects of the talus treated with fresh osteochondral allograft transplantation [J]. Foot Ankle Int，2001，22（5）：385.

[6] Langer R. Tissue engineering [J]. Science，2000，260（5110）：920-926.

[7] 叢波，张仲文.软骨组织工程种子细胞源的研究进展[J].中华灾害救援医学，2016，4（6）：341-344.

[8] Angele P，Yoo JU，Smith C，et al. Cyclic hydrostatic pressure enhances the chondrogenic phenotype of human mesenchymal progenitor cells differentiated in vitro [J]. J Orthop Res，2003，21（3）：451-457.

[9] Worster AA，Brower-Toland BD，Fortier LA，et al. Chondrocytic differentiation of mesenchymal stem cells sequentially exposed to transforming growth factor-beta1 in monolayer and insulin-like growth factor-I in a three-dimensional matrix [J]. J Orthop Res，2001，19（4）：738.

[10] Campbell JJ，Lee DA，Bader DL. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells [J]. Biorheology，2006，43（3-4）：455-470.

[11] 张仲文，侯世科，杨造成，等.基质诱导的自体软骨细胞移植术修复膝关节软骨缺损10例术后2年的随访[J].中华关节外科杂志：电子版，2010，4（6）：734-741.

[12] Koga H，Engebretsen L，Brinchmann JE，et al. Mesenchymal stem cell-based therapy for cartilage repair：a review [J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2009，17（11）：1289-1297.

[13] Lu FZ，Fujino M，Kitazawa Y，et al. Characterization and gene transfer in mesenchymal stem cells derived from human umbilical-cord blood [J]. J Laboratory Clin Med，2005，146（5）：271-278.

[14] Grande DA，Mason J，Light E，et al. Stem cells as platforms for delivery of genes to enhance cartilage repair [J]. J Bone Joint Surg，2003，85（1）：111-116.

[15] 陈佳琦，陈慧敏.间充质干细胞的研究現状与应用前景[J].北京生物医学工程，2015，34（4）：435-438.

[16] Abdallah BM，Kassem M. Human mesenchymal stem cells：from basic biology to clinical applications [J]. Gene Ther，2008，15（2）：109-116.

[17] Kuroda R，Usas A，Kubo S，et al. Cartilage repair using bone morphogenetic protein 4 and muscle-derived stem cells [J]. Arthrit Rheumat，2006，54（2）：433-442.

[18] 李丹，周广东，刘涓，等.骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板[J].组织工程与重建外科杂志，2013，9（5）：251-255.

[19] Murphy JM，Dixon K，Beck S，et al. Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis [J]. Arthrit Rheumat，2002，46（3）：704-713.

[20] 孙鹏浩.软骨细胞和骨髓间充质干细胞体外共培养的成瘤危险性的研究[D].南京：东南大学，2014.

[21] Estes BT，Diekman BO，Gimble JM，et al. Isolation of adipose-derived stem cells and their induction to a chondrogenic phenotype [J]. Nat Protocol，2010，5（7）：1294-1311.

[22] Winter A，Breit S，Parsch D，et al. Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheroids：a comparison of bone marrow–derived and adipose tissue-derived stromal cells [J]. Arthrit Rheumatol，2003， 48（2）：418-429.

[23] Wakitani S，Aoki H，Harada Y，et al. Embryonic stem cells form articular cartilage，not teratomas，in osteochondral defects of rat joints [J]. Cell Transplant，2004，13（4）：331-336.

[24] Kramer J，B？觟hrnsen F，Schlenke P，et al. Stem cell-derived chondrocytes for regenerative medicine [J]. Transplant Proceed，2006，38（3）：762-765.

[25] Ringe J，Kaps C，Burmester GR，et al. Stem cells for regenerative medicine：advances in the engineering of tissues and organs [J]. Sci Nat，2002，89（8）：338-351.

[26] Lee CR，Grodzinsky AJ，Spector M. Biosynthetic response of passaged chondrocytes in a type Ⅱ collagen scaffold to mechanical compression [J]. J Biomed Mater Res，2003， 64（3）：560.

[27] 张永涛.不连通双层PLGA支架负载自体骨髓间充质干细胞与富血小板血浆的复合体修复骨软骨缺损的实验研究[D].广州：南方医科大学，2013.

[28] 张旭东，逯卓卉，陈伟，等.用组织工程学方法探讨兔佐剂性关节炎关节软骨修复的实验研究[J].北京生物医学工程，2016，35（2）：185-190.

[29] 于洪宇，马春雨.壳聚糖-胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学变化[J].中国组织工程研究，2010，14（25）：4581-4584.

[30] 林涛，陈竹，袁德超，等.壳聚糖水凝胶复合脂肪间充质干细胞修复兔关节软骨缺损[J].中华创伤杂志，2016， 32（4）：357-362.

[31] 杨自权，何君仁，李刚，等.可塑形脱细胞软骨基质材料的制备及性状研究[J].中国修复重建外科杂志，2008， 22（10）：1232-1237.

[32] Augst AD，Kong HJ，Mooney DJ. Alginate hydrogels as biomaterials [J]. Macromol Biosci，2006，6（8）：623-633.

[33] Adachi T，Osako Y，Tanaka M，et al. Framework for optimal design of porous scaffold microstructure by computational simulation of bone regeneration [J]. Biomaterials，2006，27（21）：3964-3972.

[34] 陈哲峰，范卫民，刘峰.利用PLA、PGA、PLGA三种支架再生兔关节软骨[J].江苏医药，2005，31（8）：599-601.

[35] Vacanti CA，Langer R，Schloo B，et al. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation [J]. Plast Reconstr Surg，1991，88（5）：753-759.

[36] 刘建斌.壳聚糖-明胶/β-磷酸三钙复合体作为组织工程软骨支架材料的实验研究[J].组织工程与重建外科杂志，2010，6（6）：319-322.

[37] Dan K，Prabhakaran MP，Benjamin S，et al. Mechanical properties and，in vitro behavior of nanofiber-hydrogel composites for tissue engineering applications[J]. Nanotechnology，2012，23（9）：095705.

[38] Thorpe SD，Buckley CT，Vinardell T，et al. The response of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to dynamic compression following TGF-β3 induced chondrogenic differentiation [J]. Ann Biomed Engineering，2010， 38（9）：2896-2909.

[39] Bosnakovski D，Mizuno M，Kim G，et al. Chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs）in different hydrogels：influence of collagen type Ⅱ extracellular matrix on MSC chondrogenesis [J]. Biotechnol Bioengineering，2006，93（6）：1152-1163.

[40] 同志超，杨镇，同志勤，等.骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究[J].中国骨伤，2008，21（5）：362-364.

[41] Nixon AJ，Goodrich LR，Scimeca MS，et al. Gene therapy in musculoskeletal repair [J]. Ann New York Acad Sci，2007， 1117（1）：310-327.

[42] 付勤，王勇，于冬冬，等.外源性TGF-β1及IGF-1诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究[J].中国骨质疏松杂志，2007，13（12）：848-853.

[43] Hanada K，Solchaga LA，Caplan AI，et al. BMP-2 induction and TGF-beta 1 modulation of rat periosteal cell chondrogenesis [J]. J Cell Biochem，2001，81（2）：284-294.

[44] Matsumoto T，Kubo S，Meszaros LB，et al. The influence of sex on the chondrogenic potential of muscle-derived stem cells：implications for cartilage regeneration and repair [J]. Arthrit Rheumat，2008，58（12）：3809-3819.

[45] Guo XD，Du JY，Zheng QX，et al. Neocartilage formation in vitro using transduced mesenchymal stem cells cultured on biomimetic biodegradable polymer scaffolds [J]. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2001，23（4）：373-377.

（收稿日期：2017-03-31 本文編辑：李亚聪）