消癥软肝方联合5-氟尿嘧啶对H22荷瘤小鼠相关指标的影响*

河北省中医院肝胆科

苏春芝 都斗斗 李桑颐 郝艳超 杨泽江△(石家庄 050011)

消癥软肝方联合5-氟尿嘧啶对H22荷瘤小鼠相关指标的影响*

河北省中医院肝胆科

苏春芝 都斗斗 李桑颐 郝艳超 杨泽江△(石家庄 050011)

目的：探讨中医药在肝癌的中西医结合治疗中所发挥的作用。方法：通过癌株传代法建立H22肝癌小鼠模型，将造模成功的40只肝癌小鼠随机分为模型组、消癥软肝方组、5-氟尿嘧啶组以及消癥软肝方联合5-氟尿嘧啶组。中药组以消癥软肝方配方颗粒0.2 mL/d剂量灌胃治疗，西药组以5-氟尿嘧啶20 mg/kg·d-1腹腔注射治疗，联合用药组给予中西药物联合治疗，连续给药12 d。结果：联合用药组小鼠的脾指数、胸腺指数明显好于西药组，抑瘤率和血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达都明显优于中药组和西药组。结论：消癥软肝方具有明显的抗癌作用，能够增强5-氟尿嘧啶的抗癌效果，其作用机制与抑制肿瘤血管生成有关。

原发性肝癌；消癥软肝方;5-氟尿嘧啶；化浊解毒固本；疏肝柔肝；VEGF；MMP-9

原发性肝癌是一种极其常见的恶性肿瘤，具有隐匿性强、临床发现晚、恶性程度高、转移速度快等特点，[1]其死亡率在诸多癌症中高居第二位。据统计，近年来肝癌发病率明显上升，严重威胁着人们的健康。[2]在原发性肝癌的治疗方面，现代西医学一直占据着主导地位，但随着肝癌治疗领域的不断深入，其副作用大、生存质量低、生存期短等弊端也日益彰显。中西医结合综合疗法治疗原发性肝癌则弥补了肝癌治疗学中的诸多不足。本研究立足于原发性肝癌治疗和研究的现状，建立动物实验，拟通过观察中药治疗、化学药物治疗以及中西医联合治疗对H22荷瘤小鼠的不同作用点来深刻探讨中医药在肝癌的中西医结合治疗中所发挥的作用。

1 实验材料

1.1 动物和细胞 40只昆明小鼠，雄性，清洁级，体质量20～25 g，购买于河北省实验动物中心(合格证编号1609116)。小鼠H22肝癌细胞株，由河北医科大学生理教研室惠赠。

1.2 实验药物 消癥软肝方配方颗粒：是笔者治疗原发性肝癌的临床经验总结而成，主要由当归12 g，川芎10 g，牡丹皮12 g，郁金15 g，甲珠10 g，牡蛎15 g，薏苡仁30 g，白花蛇舌草15 g，柴胡10 g，黄芩12 g，半夏9 g，白芍、枳壳、女贞子、旱莲草各12 g等组成，由广东一方制药有限公司提供；氟尿嘧啶注射液(5-氟尿嘧啶)，规格：10 mL/0.25 g，天津金耀氨基酸有限公司。生产批号：1511121。

1.3 实验试剂 免疫组化ABC试剂盒(美国Vector公司)；抗VEGF抗体工作液(北京博奥森生物技术有限公司)；抗MMP-9抗体工作液(北京博奥森生物技术有限公司)；DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)；PBS缓冲液(北京Solarbio公司)；正常山羊血清(武汉博士德生物技术有限公司)；辣根酶标记链霉卵白素工作液(北京鸿跃创新科技有限公司)。

1.4 实验仪器 光学显微镜Olympus-BX63(日本Olympus公司)；HMIAS-2000显微图象分析系统(武汉同济医科大学)；MICROM-340E切片机(德国Zeiss公司)；精密电子天平(日本HM-200型)；干燥箱(日本三洋MIR-153型)；立式低温冷藏箱DW-40L262(青岛海尔医用低温科技有限公司)；DSHZ-300恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂)。

2 实验方法

2.1 造模和分组 将复苏的H22肿瘤细胞接种于小鼠腹腔，待生长7 d后，小鼠产生大量癌性腹水，无菌操作抽取腹水，经过离心、去上清制成肝癌细胞悬液，调整悬液的细胞浓度至细胞数为1.0×107/mL。抽取0.2 mL肝癌细胞悬液经皮下注射建立移植瘤模型，注射结束后观察造模小鼠的生命体征。造模成功后，将40只造模小鼠随机分为4组，包括模型组(M)、消癥软肝方组(Z)、5-氟尿嘧啶组(X)、消癥软肝方联合5-氟尿嘧啶组(L)，每组10只。

2.2 给药方法 于H22荷瘤小鼠造模成功后进行给药治疗，中药组给予消癥软肝方配方颗粒0.2 mL/d灌胃治疗(相当于生药0.41 g)，西药组给予小鼠5-氟尿嘧啶20 mg/kg·d-1，经皮下注射给药。联合用药组每日上午给予同等剂量的消癥软肝方制剂灌胃，下午皮下注射同等剂量5-氟尿嘧啶；模型组给予0.4 mL/d生理盐水灌胃。连续治疗12 d。

2.3 抑瘤率、脾指数、胸腺指数计算 将各实验组小鼠的肿瘤组织、脾脏、胸腺等分别称重，并计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数，用以观察不同药物干预对肝癌小鼠的肿瘤生长及肌体免疫功能的影响。公式：抑瘤率=(模型组平均瘤体质量-治疗组平均瘤体质量)/模型组平均瘤体质量×100%；脾指数=脾质量(mg)/小鼠体质量(g)×100%；胸腺指数=胸腺质量(mg)/小鼠体质量(g)×100%。

2.4 肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的免疫组化法测定 对肿瘤组织进行固定包埋、石蜡切片、脱蜡、抗原修复、封闭、一抗、二抗、DAB显色、苏木素复染、酒精梯度脱水、封片等免疫组化操作。结果判读：每张组织切片上任意观察10个视野(400倍)，以细胞内出现黄色、棕黄色或者褐色着色者为阳性，使用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统细胞测量程序测定VEGF、MMP-9反应阳性产物的平均光密度值，数值越高则说明肿瘤细胞数量越多。

2.5 肿瘤组织苏木素-伊红(HE)染色 将H22荷瘤小鼠肿瘤组织的石蜡标本进行切片，每张切片厚度约2 μm，每例肿瘤组织取3张切片，HE染色后于电子光学显微镜下观察各组小鼠肿瘤组织形态、结构的变化以及肿瘤细胞的生长情况。

3 结果

3.1 各治疗组抑瘤情况 联合用药组瘤质量最小，抑瘤率最高，明显高于中药组和西药组，差异有显著性(P<0.05)；西药组抑瘤率高于中药组，差异有显著性(P<0.05)。详见表1。

表1 不同组小鼠肿瘤生长情况 ±s)

注: 与M组比较, ΔP<0.05; 与Z组比较, *P<0.05; 与X组比较, #P<0.05

3.2 各组小鼠免疫器官指数的比较 联合用药组脾指数、胸腺指数均明显高于模型组和西药组，差异有显著性(P<0.05)；模型组、西药组脾指数差异不明显，(P>0.05)；中药组和联合用药组胸腺指数相当，差异无显著性(P>0.05)。详见表2。

3.3 小鼠肿瘤组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达 各组肝癌小鼠平均光密度值之间差异均有显著性(P<0.05)；其中模型组平均光密度值明显高于其它各组，差异有显著性(P<0.05)；中药组平均光密度值高于西药组、联合用药组，差异显著(P<0.05)；西药组高于联合用药组，2组差异明显，差异均有显著性(P<0.05)。详见表3、图1、图2。

组别只数脾指数(%)胸腺指数(%)M104918±01351763±0176Z106601±0170#2612±0153#X104789±01501210±0132L95872±0163#2524±0124#∗∗

注: 与X组比较, #P<0.05；与Z组比较, **P>0.05

表3 不同组小鼠肿瘤组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达

组别只数VEGF(MOD)MMP-9(MOD)M100161±00090171±0013Z100140±00090156±0012X100123±00160142±0012L90111±0013∗#0128±0013∗#

注: 与Z组比较, *P<0.05; 与X组比较, #P<0.05

图1 小鼠肿瘤组织中VEGF蛋白的表达

图2 小鼠肿瘤组织中MMP-9蛋白的表达

3.4 各实验组小鼠肿瘤组织的形态学改变 模型组癌细胞数量繁多，且特异性强，细胞核细胞质嗜碱性很强，镜下血管丰富；中药组大量肿瘤细胞出现变性裂解，细胞质细胞核嗜酸性增强；西药组明显出现片状肿瘤坏死区和空泡，细胞核呈现弱酸性；联合用药组部分肿瘤细胞发生坏死溶解，细胞质细胞核嗜酸性很强(见图3)。

图3 小鼠肿瘤组织的形态学变化

4 讨论

本研究从治病求本的角度出发，笔者总结在治疗原发性肝癌方面从医多年的临床经验，拟名消癥软肝方用于实验。该方以化浊解毒[3]为基本思路，在疏肝、柔肝的基础上，以柴胡作为引经药，引活血、化浊诸药直达病所，同时注重顾护脾肾，鼓舞正气，从而实现以正服邪。方中环环紧扣，既不失传统抗癌之专攻，亦不失刚柔并济之调和。方中薏苡仁[4]、白花蛇舌草[5]能够干扰肿瘤基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡；白芍[6]中的白芍总甙脂质可以明显抑制SMMC-7721、K562、BEL-7402等肿瘤细胞的增殖，具有很强的抗肿瘤活性；川芎[7]的有效成分川芎嗪，可以抑制肿瘤组织VEGF蛋白的表达，诱导肿瘤血管内皮细胞凋亡；当归[8]提取物当归多糖通过调节肌体免疫功能可以起到明显的抗肿瘤的作用；半夏[9]的重要活性成分半夏多糖可以通过激活网状内皮系统起到抑制肿瘤细胞增殖的作用；柴胡[10]的有效成分柴胡皂甙，能够诱导肿瘤细胞的凋亡和分化，控制肿瘤细胞的浸润和转移；王颖等通过动物实验发现，牡蛎能使HAC肝癌小鼠下降的免疫指标明显回升且瘤质量较模型组明显减轻，认为牡蛎可能通过增强肌体免疫功能起到抗击肿瘤的目的。[11]

研究结果显示，消癥软肝方具有明显的抑瘤作用，与5-氟尿嘧啶联合使用能够增强5-氟尿嘧啶的抑瘤效果，其作用机制与抑制 肿瘤血管生成有关。同时，消癥软肝方能够改善5-氟尿嘧啶对H22荷瘤小鼠的免疫抑制作用，明显增加肝癌小鼠的脾指数和胸腺指数，改善H22荷瘤小鼠的免疫功能。

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[4]楼婉婷, 朱珍, 谷满仓. 薏苡仁抗肿瘤作用机制的研究新进展[C].2014年全国中药学术研讨会暨中国中西医结合学会第六届中药专业委员会换届改选会论文集, 2014.202-204

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(2017-06-16 收稿)

Effect ofXiaozhengRuanganFormula Combined with 5-Fluorouracil onRelevant Indexes of H22Lumor-Bearing MiceHepatobiliary Department, Hebei Hospital of Traditional Chinese Medicine

SUChun-zhiDUDou-douLISang-yiHAOYan-chaoYANGZe-jiang

(Shijiazhuang 050011)

Objective: to explore the effect of Chinese medicine in treating hepatocarcinoma with combined therapy of TCM and western medicine. Methods: 40 H22hepatocarcinoma model mice, made by cancer strain passage method, were randomly divided into model group, Chinese medicine group (administrated withXiaozhengRuanganformula granules by 0.2 mL/d), western medicine group (injected with 5-fluorouracil by 20 mg/kg·d-1), and combination group. The administration lasted for 12 days. Results: spleen index and thymus gland index of combination group were obviously higher than that of western medicine group; inhibition rate, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expressions were superior to that of Chinese and western medicine groups. Conclusion:XiaozhengRuanganFormula has obvious anticancer effect and can enhance the antitumor effect of 5-fluorouracil, and its mechanism is related to the inhibition of tumor angiogenesis.

primary hepatocarcinoma;XiaozhengRuanganFormula; 5-fluorouracil; resolving turbidity, removing toxin and consolidating foundation; soothing liver and nourishing liver; VEGF; MMP-9

*河北省中医药管理局资助项目: No.2016037

R256.42

A

1007-5615(2017)04-0001-04

△河北医科大学2015级硕士研究生(石家庄 050017)

实 验 研 究