羧甲基茯苓多糖体外抗氧化活性研究

熊芳琪，刘 欣，杨 岚，彭国平

(湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128)

羧甲基茯苓多糖体外抗氧化活性研究

熊芳琪，刘 欣，杨 岚，彭国平

(湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128)

目的：比较不同浓度洗脱液洗脱得到的羧甲基茯苓多糖的抗氧化活性。方法：以茯苓为原料提取茯苓多糖，进行羧甲基取代反应，分离和纯化得到了均一性羧甲基茯苓多糖CMP-1、CMP-2、CMP-3、CMP-4，通过测定还原能力、DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率比较其体外抗氧化活性。结果：羧甲基茯苓多糖均表现出与浓度正相关的体外抗氧化活性，其中CMP-4具有相对更强的体外抗氧化活性。结论：所得羧甲基茯苓多糖样品具有不同的体外抗氧化能力，随着洗脱液浓度增加，抗氧化活性增强。

茯苓；羧甲基茯苓多糖；抗氧化活性

茯苓作为多孔菌科真菌的干燥菌核，具有利尿、调节免疫、镇静、抗肿瘤、保肝等作用[1]， 其主要组成是茯苓多糖，约占干重的90%左右。

本研究采用二次加碱法[2]提取羧甲基茯苓多糖(CMP)，并进行分离纯化得到不同组分的羧甲基茯苓多糖，采用4种不同的体外抗氧化测定体系进行抗氧化活性测定，为开发利用羧甲基茯苓多糖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

茯苓菌块，采自湖南靖州白茯苓。二苯代苦味肼自由基(DPPH)，Sigma 公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、冰醋酸、氯乙酸、过氧化氢、三氯化铁、水杨酸、三氯乙酸、铁氰化钾，分析纯国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羧甲基茯苓多糖的制备 将茯苓菌块，粉碎过 60 目筛备用。精密称取茯苓粉，加入 20 倍的水，超声 30 min 后沸水浸提 2 h，过滤，用 5 倍的 NaOH 碱溶液浸提茯苓渣，置于4 ℃ 处理，抽滤得碱液，加入氯乙酸和 NaOH 溶液，70 ℃ 醚化反应 3 h，用乙酸中和至 pH 为7，采用 Sevage 法除去蛋白，活性炭吸附脱色，醇沉，离心，沉淀用水、无水乙醇、丙酮、无水乙醚进行洗脱，干燥，粉碎，得羧甲基茯苓多糖粉 CMP。

1.2.2 羧甲基茯苓多糖的分离纯化[3]取一定量的 CMP 溶于双蒸水，上样到已平衡的 DEAE-52 离子交换柱上，用不同浓度的氯化钠溶液洗脱，蒽酮硫酸法跟踪检测，根据洗脱曲线的主峰位合并收集液，透析，干燥，得到 5 个羧甲基茯苓多糖纯化组分。将得到的 5 个组分分别溶解，上样到已平衡的SephadexG-100 葡聚糖凝胶过滤层析柱，采用氯化钠溶液洗脱，根据洗脱曲线的主峰位合并收集液，透析脱盐，冷冻干燥，得到羧甲基茯苓多糖均一组分CMP-1、CMP-2、CMP-3和CMP-4，并根据峰面积计算各组分多糖含量。

1.2.3 还原能力的测定[4-6]配制浓度为10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，稀释成不同浓度梯度。向1.0 mL羧甲基茯苓多糖溶液中加入0.2 mL PBS(0.2 mol/L，pH值6.6)和1.5 mL 0.3 % 铁氰化钾，摇匀，50 ℃ 恒温反应30 min。加入1.0 mL三氯乙酸(10%)，3 000 r/min 离心10 min，取2 mL上清液与0.5 mL 三氯化铁溶液(0.1%)，再加3 mL 蒸馏水混匀，蒸馏水调零，在700 nm 处测定吸光度。溶液吸光度越高，表示还原能力越强。

1.2.4 DPPH自由基清除率测定[7]配制浓度为10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀释成不同的浓度梯度。将2.0 mL的羧甲基茯苓多糖样品溶液加入到2 mL DPPH 溶液中，混合均匀并在黑暗中反应30 min，测定517 nm处的吸光度。DPPH自由基清除率计算公式按式(1)计算：

清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

(1)

式(1)中，Ao为水代替样品溶液的吸光度；A1为样品溶液的吸光度；A2为乙醇代替DPPH溶液时的吸光度。

1.2.5 羟基自由基的清除率测定[8]配制浓度为10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀释成不同的浓度梯度。依次加入2.0 mL FeSO4(9.0 mmol/L)溶液、2.0 mL水杨酸(9.0 mmol/L)溶液、2.0 mL样品溶液，然后加入2.0 mL H2O2(8.8 mmol/L)启动整个反应，37℃水浴后，以蒸馏水为对照，在510 nm 下测吸光度。羟基自由基清除率计算公式按式(2)计算：

清除率=[A3-(AX-AX0)]/ A3×100%

(2)

式(2)中，A3为不加样品溶液的吸光度；Ax为加入样品溶液后的吸光度；Axo是没有添加显色剂时样品的吸收值。

1.2.1 不同灌水量对啤酒大麦生长的影响测定 灌水量单因素5水平随机区组设计，3次重复，每个处理的总灌水量分别为 W1：0 m3/hm2，W2：750 m3/hm2，W3：1500m3/hm2，W4：2250m3/hm2，W5：3000m3/hm2。试验小区面积10 m2(2.5 m×4 m)，灌水分4次进行，如表1所示。条播，行距17 cm，播种深度3～5 cm；撒播先整理好小区后将种子均匀撒开，然后深犁，耙耱。试验于2017年3月26日种植。

1.2.6 超氧阴离子自由基的清除[9]配制浓度为10 mg/mL 羧甲基茯苓多糖溶液，并稀释成不同的浓度梯度。取pH为8.2的Tris- HCl 缓冲液6 mL于比色管中，各自加入0.5 mL样品溶液，37 ℃ 水浴10 min，然后加入预热过的邻苯三酚溶液，混匀，精确处理5 min，立刻用0.5 mL浓盐酸打断反应，测320 nm 处吸光值。对照组以Tris-HCl 缓冲液代替羧甲基茯苓多糖溶液。超氧自由基清除率按式(3)计算：

清除率=(A4-A5)/A4×100%

(3)

式(3)中：A4为加入样品溶液后的吸光度；A5为对照组吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 羧甲基茯苓多糖分离结果

用不同浓度的氯化钠溶液先后，0.05、0.1、0.15、0.2mol/L对层析柱进行洗脱。由图1可以得知，经过 DEAE-52 纤维素层析柱对羧甲基茯苓多糖进行洗脱分离，主峰位合并得到4个多糖组分，分别是0.05 mol/L 氯化钠溶液洗脱出来CMP-1，占总糖含量的8.47%；0.1 mol/L 氯化钠溶液洗脱出来的组分CMP-2，占总糖含量的17.97%；0.15 mol/L 氯化钠溶液洗脱出来的组分CMP-3，占总糖含量的13.56%；0.2 mol/L 氯化钠溶液洗脱出来的组分CMP-4，占总糖含量的20.00%。洗脱出的多糖含量为总糖含量的60.00 %。从图1中可看出4个洗脱峰明显，说明其分离效果好。

2.2 还原能力测定结果

根据抗氧化活性成分的还原能力清除自由基，检测吸光度，吸光度越大，还原能力越强，抗氧化能力越强。由图2可知，所有样品的还原能力与浓度呈正相关，还原能力大小依次为CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

2.3 DPPH自由基清除率

DPPH自由基可清除其他自由基，清除率越大，抗氧化能力越强[10]。由图3可知，4种样品对DPPH自由基的清除率都与浓度呈正相关，清除能力大小依次为CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

图1 羧甲基化茯苓多糖DEAE-52洗脱曲线

图2 羧甲基茯苓多糖的还原能力

2.4 羟基自由基清除率

H2O2/Fe2+通过Fenton 反应生成羟自由基，羟自由基能与水杨酸结合，产生在510nm处强吸收峰物质，加入具有清除作用溶液，则会与水杨酸竞争，使得显色物质减少[11]。由图4可知，所有样品对羟基自由基的清除率与浓度均成正相关，清除能力大小依次为CMP-4>CMP-3>CMP-2>CMP-1。

2.5 超氧阴离子自由基清除率

超氧自由基的清除能力是反应药物抗氧化能力的重要指标，在邻苯三酚-鲁米诺-碳酸缓冲液体系下测定羧甲基茯苓糖清除超氧阴离子的作用，经过反应后，超氧自由基形成其他的氧自由基[12]。由图5可知，所有样品对超氧阴离子自由基的清除率与浓度均成正相关。清除能力在0.6～4.0 mg/mL时，清除能力较差。当样品浓度达到4.0 mg/mL时，CMP-4的清除率明显高于其他3个样，达到了20.46%。

3 结论

从茯苓中提取、进行羧甲基反应、分离和纯化得到了均一性羧甲基茯苓多糖CMP-1、CMP-2、CMP-3、CMP-4。利用化学发光法评价体外抗氧化活性，表明羧甲基茯苓多糖对DPPH自由基和羟基自由基具有较好的清除作用，具有较高还原力和抗氧化能力。羧甲基茯苓多糖均表现出在一定浓度范围内与体外抗氧化活性呈正相关，其中CMP4具有相对更强的体外抗氧化活性。

图3 DPPH自由基清除率 图4 羟基自由基清除率 图5 超氧阴离子自由基清除率

4 讨论

采用不同浓度的NaCl溶液，经DEAE-52纤维素层析柱对羧甲基茯苓多糖进行洗脱分离，得到的羧甲基茯苓多糖样品具有不同的体外抗氧化能力，且随着洗脱液浓度增加，抗氧化活性增强，其中0.2mol/mL的NaCl溶液洗脱得到的CMP-4抗氧化活性相对较好。羧甲基茯苓多糖具有较强的还原能力和较好的抗氧化活性，对羧甲基茯苓多糖的结构和抗氧化活性间的关系进行研究，将有利于羧甲基茯苓多糖的进一步开发和利用。◇

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(责任编辑 李婷婷)

Antioxidant Activity of Carboxymethyl-Pachyman

XIONG Fang-qi，LIU Xin，YANG Lan，PENG Guo-ping

(College of Biological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

Poriacocos；carboxymethyl-pachyman；antioxidant activity

熊芳琪(1993— )，女，硕士研究生，研究方向：生物活性成分应用。

彭国平(1966— )，男，副教授，研究方向：中草药开发与应用。