乳杆菌ALAC-3产抑酵母菌活性物质培养基的优化

（内蒙古农业大学，食品科学与工程学院，呼和浩特010018）

乳杆菌ALAC-3产抑酵母菌活性物质培养基的优化

郑中文，李晓婷，刘静，高鹤尘，李海暄，赵洁，陈忠军

（内蒙古农业大学，食品科学与工程学院，呼和浩特010018）

从内蒙古传统乳酸发酵食品中筛选出具有较强抑酵母菌作用的一株乳杆菌ALAC-3。从8组适合乳杆菌菌株生长的培养基中筛选出代谢产生抑酵母活性物质的最优培养基，再通过单因素和正交实验，确定培养基中最适宜组分和适宜添加量。结果表明，碳源、氮源对菌株产抑菌物质有显著的影响，最优培养基为：蔗糖25 g/L，蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）20 g/L，K+：Mg2+：Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L，生长因子乙醇2 mL/L。以此培养基培养ALAC-3，其抑菌圈可达32.68 mm，比培养基优化前（抑菌圈29.91 mm）提高了9.3%。

乳杆菌；抑酵母菌作用；培养基；优化

0 引言

食品在生产到销售过程中易混入病原菌和腐败菌，危害消费者健康[1]。近年食品安全事故频发就是这一危害不断扩大的结果[2]，而以酵母菌等真菌的污染最严重。据统计，每年因酵母菌污染而浪费的粮食达2%[3]。

乳杆菌作为益生菌，可以提高食品营养、保藏性和附加值，改善食品风味[4-5]。同时，乳杆菌能够调节机体肠道菌群，降胆固醇[6-8]，对机体生理功能、免疫反应等产生作用[9]，被广泛用于工业生产[10]。目前研究发现，乳杆菌代谢可产生对近源或同种菌种有特异性抑制作用的细菌素[11]，但对酵母菌等真菌作用不明显[12]。

本研究从内蒙古发酵食品中分离出具有抑酵母菌特性的乳杆菌ALAC-3，通过优化其培养基组分，以获得最大抑菌物质产量，为该抑菌活性物质的进一步分离纯化和结构分析提供参考。

1 实验

1.1 材料与仪器

乳杆菌：ALAC-3，分离自内蒙古传统发酵食品中。

指示菌：白假丝酵母（Candida albicans）标准菌株，编号为32819，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

酵母膏，牛肉膏，胰蛋白胨，大豆蛋白胨，细菌学蛋白胨，氯化钠，柠檬酸氢二胺，磷酸氢二钾，硫酸锰，硫酸镁，葡萄糖，琼脂粉，硫酸铵，TWEEN 80，无水氯化钙，Trizma碱，无水甲醇，冰乙酸，Bromophenol blue，均为分析纯。

筛选用培养基：M17肉汤培养基，改良番茄汁培养基，番茄汁分离培养基，改良MC培养基，MRS肉汤培养基，莫匹罗星锂盐改良MRS培养基，乳酸杆菌肉汤培养基，Elliker肉汤培养基。各培养基配方及编号如表1所示[13]。

SW-CJ-2FD双人单面垂直净化工作台，BCD-249CF美菱冰箱，DPX-9162B-1电热恒温培养箱，可见分光光度计，KDC-140HR高速冷冻离心机，HPX-9052 MBE数显电热培养箱，L600低速自动平衡离心机，旋转蒸发仪。

1.2 方法

1.2.1 ALAC-3生长培养基的筛选

（1）各培养基的配制。按表1所示将各组分依次加入，搅拌均匀，调节pH值，灭菌。

表1 筛选用培养基及配方g/L

（2）ALAC-3抑菌物质浓缩液的处理。将充分活化后的ALAC-3按4%接种量分别接种到各筛选培养基中，在30℃温度下培养36 h，发酵液经过去酸化去除有机酸后离心分离去沉淀（4 000 r/min，10 min），上清液按4%比例浓缩，即为抑菌活性物质浓缩液[14]。

（3）牛津杯法测定抑菌性。牛津杯法，全称是牛津杯双层琼脂扩散法，方法是将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒入培养皿内，每皿15 mL（下层），待其冷却凝固后在固体琼脂上均匀放置3只牛津杯。将融化的指示菌（白假丝酵母）培养基冷却到50℃左右接入指示菌，将混有指示菌的培养基5 mL加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。在牛津杯中分别加入等量抑菌物质浓缩液，37℃培养16～18 h。在培养皿中，一方面指示菌开始生长，另一方面抑菌物质浓缩液呈球面扩散，离杯越近，浓缩液浓度越大，离杯越远则浓度越小。随着浓缩液浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就是“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌性越强，抑菌圈越大，从而抑菌圈的直径可以指示其抑菌性强弱（抑菌物质浓度大小）[15]。

（4）ALAC-3生长培养基的筛选。分别收集各筛选培养基培养出的ALAC-3的抑菌物质浓缩液，按牛津杯法测定其抑菌性，浓缩液添加量均为1 mL，37℃下培养16～18 h，测量抑菌圈直径。比较抑菌圈直径大小，选择抑菌圈最大的浓缩液对应的培养基为最佳培养基。

1.2.2 培养基组分和含量的优化

（1）单因素实验。碳源：从常用碳源中选取葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、棉子糖、鼠李糖、蔗糖、麦芽糖11种糖作为碳源等量替换原培养基中的碳源，接入ALAC-3培养后按1.2.1（2）所示方法收集浓缩液，牛津杯法测定抑菌性，比较抑菌圈大小，选择最大抑菌圈对应的碳源。

氮源：选取蛋白胨、牛肉膏和酵母膏的不同比例组合作为氮源，等量替换原氮源，具体方法同上。比较抑菌圈大小，选择最大抑菌圈对应的氮源。

金属离子：选取Na+、K+、Mn2+、Mg2+的不同比例组合作为金属离子，替换原培养基中的金属离子，方法同上。比较抑菌圈大小，选择最大抑菌圈对应的金属离子。

生长因子：选取吐温20（Tween 20）、吐温80（Tween 80）、PEG-400、乙醇作为生长因子，方法同上，比较抑菌圈大小，选择最大抑菌圈对应的生长因子。

（2）正交实验设计。根据单因素试验结果，选择碳源、氮源、金属离子和生长因子作4因素3水平的正交试验设计，按L9（34）正交表设计试验。分析试验结果，确定最优培养基组分及含量。

2 结果与讨论

2.1 ALAC-3生长培养基的筛选

使用表1中8种不同的培养基培养ALAC-3，测定抑菌物质浓缩液的抑菌圈直径，结果如表2所示。

表2 不同培养基对抑菌物质浓缩液抑菌性的影响

由表2可以看出，5号培养基抑菌物质浓缩液的抑菌圈最大；2，3，4号培养基培养ALAC-3时，菌体无法生长或者无法代谢产生抑菌物质。因此，根据试验结果选定MRS肉汤培养基作为后期优化用的培养基。

2.2 优化培养基组分和含量

微生物培养基的组成大致分为碳源（C源）、氮源（N源）、金属离子、生长因子。在单因素试验中，分别用不同碳源、氮源、金属离子、生长因子等量替换原培养基中的相应成分，比较替换前后ALAC-3产生的抑菌物质抑菌性强弱，从而确定各类组分的最佳成分和适宜添加量范围[16]。

2.2.1 不同碳源对抑菌性的影响

选用不同的碳源代替原培养基中的碳源时，所得抑菌物质浓缩液的抑菌情况如图1。

图1 不同碳源对抑菌物质抑菌性的影响

由图1可以看出，甘露糖作为碳源时所得抑菌物质浓缩液的抑菌圈最大，蔗糖次之，且数值低不到3%。考虑到甘露糖价格较高，以蔗糖作为较优碳源。

2.2.2 不同氮源对抑菌性的影响

选用不同的氮源代替原培养基中的氮源，所得抑菌物质浓缩液的抑菌情况如图2所示。

图2 不同氮源对抑菌物质抑菌性的影响

图2中，横坐标数值1为蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶2∶1）；2为蛋白胨；3为牛肉膏；4为酵母膏；5为蛋白胨∶牛肉膏（5∶3）；6为蛋白胨∶酵母膏（5∶3）；7为牛肉膏∶酵母膏（1∶1）；8为蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）。

由图2可以看出，8号氮源时所获得抑菌圈最大，即蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）作为培养基的氮源。

2.2.3 不同金属离子对抑菌性的影响

选用不同金属离子代替原培养基中的组分，实验结果如图3所示。

图3 不同金属离子对抑菌物质抑菌性的影响

图3中，横坐标数值1为Na+∶K+∶Mg2+∶Mn2+（30∶10∶3∶1）；2为Na+∶Mg2+（10∶1）；3为Na+∶Mn2+（30∶1）；4为K+：Mg2+（10∶3）；5为K+∶Mn2+（10∶1）；6为Na+∶Mg2+：Mn2+（30∶3∶1）；7为K+：Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）。

由图3可以看出，选择7号金属离子时，获得最大抑菌性（产量），即K+∶Mg2+∶Mn2+为10∶3∶1。

2.2.4 不同生长因子对抑菌性的影响

用不同生长因子代替原组分（总量3 mL/L），结果如图4所示。

图4 不同生长因子对抑菌物质抑菌性的影响

由图4可以看出，添加乙醇作为生长因子获得的抑菌物质的抑菌性远高于其他生长因子，因此选择生长因子为乙醇。

2.2.5 正交试验设计优化各组分最佳用量

采用L9（34）正交表，以蔗糖（A）、蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏=2∶1∶1（B）、K+∶Mg2+∶Mn2+=10∶3∶1（C）、乙醇（D）作为4个考察因素，选取3个水平进行试验。各因素及水平如表3所示；数据结果如表4所示。

表3 正交实验因素水平

表4 实验设计及数据结果

对实验结果进行显著性分析，结果如表5所示。

表4的极差分析表明，RA＞RB＞RD＞RC。由表5可知，碳源（A）、氮源（B）对抑菌结果有显著影响（Sig.＜0.05），其中碳源（A）对抑菌性有极显著影响（Sig.＜0.01）。试验数据方差R2=0.986，表明结果可信度较高。4个因素对抑菌物质抑菌性影响大小为：碳源（A）〉氮源（B）〉生长因子（D）〉金属离子（C）。在实验设计范围内，优化得到培养基组分的最佳值为A3B1C2D2，即蔗糖25 g/L；蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）20 g/L；K+∶Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L；乙醇2 mL/L。用此优化培养基进行培养，所得抑菌物质浓缩液的抑菌圈直径为32.68 mm，比用优化前培养基培养时（抑菌圈29.91 mm）提高了9.3%。

表5 显著性分析结果

3 结论

本研究从内蒙古当地传统发酵食品中分离出一株具有较强抑酵母菌活性的乳杆菌ALAC-3，在选择较优培养基的基础上，采用单因素和正交实验法研究碳源、氮源、金属离子、生长因子对菌株产抑菌物质的影响。确定了最适宜ALAC-3代谢产生抑酵母活性物质的培养基组分为：蔗糖25 g/L；蛋白胨∶牛肉膏∶

酵母膏（2∶1∶1）20 g/L；K+∶Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L；乙醇2 mL/L；为下一步抑菌物质的分离纯化及结构鉴定奠定了基础。

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Medium optimization of antiyeast active substances produced by Lactobacillus ALAC-3

ZHENG Zhongwen,LI Xiaoting,LIU Jing,GAO Hechen,LI Haixuan,ZHAO Jie,CHEN Zhongjun
(Inner Mongolia Agricultural University,College of Food Science and Engineering,Hohhot 010018,China)

The inhibiting activity of antiyeast substances produced by Lactobacillus ALAC-3,one strain isolated from traditional dairy fermen⁃tation food in Inner Mongolia was studied.In this study,one best was singled out of eight culture media that suited ALAC-3 to grow and produce antiyeast active substances.Then the best components and its volume range were confirmed by Single-Factor experiments and Or⁃thogonal experimental design.Experimental results indicated that the carbon source,nitrogen source significantly affected the inhibiting activi⁃ty on yeast.When the parameters were composed as follows:25 g/L of sucrose,20 g/L of peptone∶beef extract∶yeast extract(2∶1∶1),0.1 mol/L of K+-Mg2+-Mn2+（10∶3∶1）,2 mL/L of ethanol as growth factor,the inhibiting activity was maximum with verified value of 32.68 mm,increased by 9.3%from the initial value of 29.91 mm.

Lactobacillus;inhibiting yeast function;medium;optimization

TQ935

：A

：1001-2230（2017）07-0023-04

2016-11-25

内蒙古自然基金（2015MS0364）；国家自然基金(31260390)。

郑中文（1990-），男，硕士，研究方向为食品微生物。

陈忠军