一测多评法测定沙棘鲜果中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量

刘 峰，马久太，王浩仁，李 瑾，党艳妮，李 炜

（1.陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046； 2.陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710061）

·检验检测·

一测多评法测定沙棘鲜果中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量

刘 峰1，2，马久太1，王浩仁1，李 瑾1，党艳妮1，李 炜1，2

（1.陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046； 2.陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710061）

目的建立一测多评法测定沙棘果中槲皮素、山柰素和异鼠李素3种成分的含量，并验证其在沙棘果质量评价中的应用价值。方法色谱柱采用Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为甲醇－0.4%磷酸溶液（56∶54），流速为1.0 mL／min，柱温30℃，进样量10 L，检测波长370 nm。以槲皮素为对照品，建立其与山柰素、异鼠李素的相对校正因子，并用该校正因子计算各成分含量，实现一测多评，同时采用外标法验证一测多评法的准确性和可行性。结果槲皮素与山柰素、异鼠李素的相对校正因子分别为0.949 9和1.027 5，一测多评法的计算值与外标法实测值间无显著差异。结论以槲皮素为对照品，同时测定沙棘果中槲皮素、山柰素、异鼠李素的一测多评法准确可靠，可为沙棘果中黄酮类成分的质量控制提供科学依据。

一测多评；沙棘果；槲皮素；山柰素；异鼠李素；含量测定

沙棘是胡颓子科沙棘属 Hippophae rhamnoides L.浆果植物，又名酸刺、黑刺、醋柳，为落叶灌木或木乔，广布于我国青海、新疆、内蒙、陕西等地，在保持水土、改善环境等方面发挥着重要作用。以沙棘果为原料可制成多种制剂如沙棘片、沙棘膏、心达康片等，沙棘黄酮为沙棘果中主要的活性成分[1]，具有抗心肌缺血、抗心律失常、提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇等广泛的药理功效。临床试验证明，沙棘黄酮具有治疗缺血性心脏病、心绞痛、心肌缺血等疾病的作用[2]。沙棘黄酮按化学结构分为6类约32种，以槲皮素、异鼠李素、山柰素及其苷类为优势活性成分。本研究中参考文献[3－10]，采用一测多评(QAMS)法，建立了以槲皮素为对照品，测定沙棘果槲皮素、山柰素和异鼠李素含量的方法，具有简单、准确、专属性强的特点，可为沙棘果中黄酮类成分的质量控制研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(Waters公司)；LC－2010AHT型高效液相色谱仪(岛津公司)；AR1140，DV215CD型电子天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）；TDL－5－A型离心机（上海安亭科学仪器厂）；优普UPT－Ⅱ－5L型超纯水机（成都超纯科技有限公司）。

1.2 试药

对照品槲皮素（批号为 100081－200907，含量为96.5%），山柰素（批号为 110861－201209，含量为93.2%），异鼠李素（批号为 110860－200406，含量为99.9%），均购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯（美国Fisher）；磷酸为色谱纯，盐酸为分析纯（天津科密欧化学试剂有限公司），水为超纯水。沙棘果分别采自陕西延安市、甘肃临夏州、宁夏固原市和陕西咸阳市，经陕西省食品药品检验所郭耀武主任药师鉴定为胡颓子科植物沙棘 Hippophae rhamnoides L.的果实。

2 方法与结果

2.1 QAMS的建立

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－0.4%磷酸溶液（56∶44）；检测波长：370 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL／min；进样量：10 μL。在此色谱条件下，各成分分离良好，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

分别称取槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成含槲皮素、山柰素和异鼠李素质量浓度分别为0.032 46，0.010 26，0.142 4 g／L的混合对照品溶液。取沙棘果约100 g，精密称定，除去沙棘籽，果肉搅拌均匀，称重，取约15 g，精密称定，加乙醇30 mL，搅拌均匀，加热回流1 h，离心，弃去油层，沉淀及上清液搅拌均匀，转移至锥形瓶中，加盐酸6.0 mL，混匀，加热回流1 h，放凉，用70%乙醇定容至50 mL容量瓶，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液[11－15]。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液3，5，10，15，20 μL，分别注入色谱仪，测定，记录峰面积。以混合对照品进样量（X，μg）为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归。结果见表1。

表1 3种成分线性关系考察结果

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，按照2.1.1项色谱条件，重复进样6次，记录峰面积。结果见表2，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取沙棘果（陕西延安市）样品，平行6份，分别按 2.1.2项下方法制备供试品溶液，进样，记录色谱图，计算含量。结果见表3，表明该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一份制备好的供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样，记录峰面积。结果见表4，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：取沙棘果（陕西延安市）约100 g，精密称定，平行6份，除去沙棘籽，果肉搅拌均匀，称重，精密称定约7.5 g，分别加入混合对照液 10 mL（槲皮素0.082 g／L，山柰素0.025 87 g／L；异鼠李素0.379 2 g／L），加乙醇20 mL，后续按照2.1.2项方法制备供试品溶液，测定并计算加样回收率。结果见表5，表明方法准确度良好。

表2 精密度试验结果

表3 重复性试验结果

表4 稳定性试验结果

表5 加样回收试验结果（n＝6）

2.2 校正因子计算

取混合对照品溶液，在2.1.1项色谱条件下，取3，5，10，15，20 μL进样测定，记录各成分的峰面积，以槲皮素为对照，按公式计算。fsi＝fs／fi＝(AS／CS)／(Ai／Ci)，式中 AS为对照品峰面积，CS为对照品质量浓度；Ai为待测成分对照品峰面积，Ci为某待测成分对照品浓度。结果见表6。

表6 槲皮素与山柰素、异鼠李素的相对校正因子

2.3 相对校正因子与相对保留时间重现性考察

2.3.1 不同高效色谱仪和色谱柱的考察

取2.1.2项下已制备好的混合对照品，按照拟订色谱条件分别考察岛津LC－2010AHT及Waters e2695高效液相色谱仪；Agilent XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Kromasil 100－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Thermo Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱的相对校正因子。结果见表7。

表7 不同色谱仪和色谱柱相对校正因子考察（n＝5）

2.3.2 待测组分色谱峰的定位

按照2.3.1项方法进样，测定并计算待测成分山柰素和异鼠李素与对照品槲皮素的相对保留时间（RRT）。结果见8。

2.4 测定结果比较

按2.1.2项下方法制备不同产地沙棘果供试品溶液，照2.1.1项色谱条件测定。采用外标法（ESM）和QAMS法同时测定样品中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量。结果见表9。

表8 不同色谱仪和色谱柱RRT考察（n＝5）

表9 QAMS与ESM测定沙棘果中黄酮类成分的含量比较（mg／g，n＝5）

通过计算ESM法实测含量与QAMS法计算的含量之间的夹角余弦值验证QAMS法的准确性[16]。外标法和一测多评法测得的山柰素、异鼠李素含量之间的夹角余弦值分别为0.999 95，0.999 98，表明两种方法测定结果无显著差异，建立的QAMS法可用于沙棘果黄酮类成分的多指标成分质量评价。

3 讨论

3.1 提取方式选择

沙棘黄酮类成分富集于果肉和果皮中[17]，为减少油脂等其他成分对检测的影响，在供试品溶液的制备时采用挤压除去沙棘籽。另外，沙棘果肉中果油含量较高，曾试验用有机溶剂萃取，除去沙棘果油，但在萃取过程中易发生乳化，影响后续操作，故选择离心方法除去沙棘果油。

3.2 检测波长选择

分别取槲皮素、山柰素和异鼠李素的对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果槲皮素在255.6 nm和370.1 nm有较大吸收峰，山柰素在264.0 nm和 370.0 nm处吸收较大，异鼠李素在 254.5 nm和370.1 nm处吸收大。根据各成分的吸收情况，选择370 nm为测定波长。

3.3 方法优势

QAMS法使用一种对照物质，利用相对校正因子同时测定多种成分含量，可选易得、廉价的典型成分测定多种成分的含量[6－7]，大大节省了检验成本，简化了实验操作，提高了工作效率。槲皮素、山柰素和异鼠李素均为黄酮类化合物，以槲皮素为对照品测定3种成分含量，可满足QAMS法测定要求[6，16]，可为沙棘鲜果的质量控制提供了一种简单、可靠的方法。

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Content Determination of Quercetin,Kaempferide and Isohamnetin in Hippophae Rhamnoides L.by Quantitative Analysis of M ulti－Components by Single M arker

Liu Feng1,2,Ma Jiutai1,Wang Haoren1,Li Jin1,Dang Yanni1,Li Wei1,2
(1.Shaanxi Institute of International Trade Commerce,Xianyang,Shaanxi,China 712046; 2.Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co.LTD.,Xi′an,Shaanxi,China 710061)

Objective To establish a quantitative analysis of multi－components by single marker(QAMS)method for determing the content of quercetin,kaempferide,isohamnetin in Hippophae Rhamnoides L.,and test the application value of QAMS in the quality control of Hippophae Rhamnoides L..M ethods The Agilent C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was adopted,the mobile phase was methol－0.4% phosphoric acid solution(56∶44),the flow rate was 1.0 mL／min,the column temperature was 30℃,the injection volume was 10 μL,and the detection wavelength was set at 370 nm.By using quercetin as reference,the relative correction factors(RCF)of kaempferol and isorhmnetin were calculated.The method was evaluated by comparison of the quantitative results through external standard method and QAMS method.Results The RCF of kaempferide and isohamnetin with reference to quercetin were 0.949 9,1.027 5.There isno significantdifference between the calculated value ofQAMS method and the measured value ofexternalstandard method.Conclusion With the quercetin as reference,simultaneous determination of quercetin,kaempferide,isohamnetin in Hippophae Rhamnoides L.by QAMS method is accurate and reliable,which can provide scientific basis for the quality control of the flavonoids in Hippophae Rhamnoides L..

quantitative analysis of multi－components by single marker;Hippophae Rhamnoides L.;quercetin;kaempferide;isohamnetin; content determination

R284.1

A

1006－4931(2017)13－0024－04

2017－03－03；

2017－04－18)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.13.007

陕西省重点科技创新团队计划[2015KCT－19]；陕西省创新药物研究中心项目[2015SF2－09]；陕西省咸阳市重大科技专项计划项目[2014k01－18]。

刘峰（1969－），男，博士研究生，主任药师，研究方向为新药研发，（电子信箱）xinyao21＠126.com。