益生芽孢杆菌对草鱼肠黏膜结构的保护作用

黄 灿张忠海吴淑勤张 丁李思思陈孝煊吴志新

(1.华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 池塘健康养殖湖北省工程实验室, 武汉 430070; 2.中国水产科学研究院珠江水产研究所, 广州 510380)

益生芽孢杆菌对草鱼肠黏膜结构的保护作用

黄 灿1张忠海1吴淑勤2张 丁1李思思1陈孝煊1吴志新1

(1.华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 池塘健康养殖湖北省工程实验室, 武汉 430070; 2.中国水产科学研究院珠江水产研究所, 广州 510380)

为了研究益生菌对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道黏膜结构的保护作用, 选取健康草鱼随机分成3组: ①对照组: 口灌无菌PBS 0.2 mL/尾后第2和第4天分别口灌无菌PBS 0.1 mL/尾; ②嗜水气单胞菌组(Ah组):口灌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)菌液0.2 mL/尾(1.0×107cfu/mL)后第2和第4天分别口灌无菌PBS 0.1 mL/尾; ③枯草芽孢杆菌保护组(Ah+Bs组): 口灌嗜水气单胞菌菌液0.2 mL/尾后第2和第4天分别口灌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌液0.1 mL/尾(1.0×107cfu/mL); 连续7d取中肠中部, 通过检测草鱼肠黏膜形态及肠上皮细胞微丝骨架的变化, 旨在研究益生枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌造成的肠黏膜结构损伤的保护作用。结果表明: Ah组病变主要表现为肠道黏膜上皮细胞变性, 坏死, 大量脱落; 固有层出血、水肿变粗; 大量炎性细胞浸润; 超微结构变化表现为紧密连接缝隙明显变宽; 微绒毛萎缩变短, 稀疏, 排列紊乱; 线粒体可见明显肿胀、嵴减少, 内质网明显扩张; 肠上皮细胞中的微丝呈绿色雾状, 微丝荧光强度逐渐减弱, 明显低于对照组。与Ah组相比, Ah+Bs组上述病变有明显改善, 肠道黏膜上皮细胞轻微脱落, 炎症和出血等症状明显减轻; 紧密连接缝隙明显变窄; 微绒毛数量多且排列较整齐; 线粒体无明显肿胀; 肠上皮细胞中的微丝荧光强度高于Ah组。结果说明益生芽孢杆菌对嗜水气单胞菌造成的肠黏膜结构损伤有一定的保护作用。

益生枯草芽孢杆菌; 嗜水气单胞菌; 草鱼; 肠黏膜; 微丝骨架

草鱼在高密度集约化和工厂化养殖过程中, 经常遭受细菌、病毒和寄生虫等病原的感染而引发各种各样的疾病。在细菌引起的疾病中, 由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的细菌性肠炎是草鱼养殖过程中最为常见的疾病之一[1]。目前对嗜水气单胞菌引起的疾病多采用抗生素治疗, 但抗生素大量使用带来的药物残留和耐药菌株等负面影响已引起了学术界和消费者的高度关注[2]。利用绿色环保的芽孢杆菌替代抗生素来防治疾病已在养殖业上得到应用, 芽孢杆菌能促进水生动物的生长[3], 提高水生动物的免疫功能[4], 还能维持水生动物肠道微生态的平衡[5]。肠道结构和功能正常是营养物质被消化吸收的前提, 研究表明, 芽孢杆菌可以促进动物肠道的生长发育, 提高肠壁厚度、肠黏膜高度以及肠绒毛密度等[6]。枯草芽孢杆菌可提高草鱼肠道皱襞高度以及微绒毛高度、宽度和密度[7];芽孢杆菌可使鲤前肠皱褶增多、隐窝加深, 微绒毛粗长而密集, 肠吸收面积增大[8]。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Ch9是分离自草鱼的一株益生菌, 已证明对草鱼的生长有良好的促进作用[9]。本实验给感染嗜水气单胞菌的草鱼口灌一定剂量的枯草芽孢杆菌, 通过检测草鱼肠道结构及肠上皮细胞微丝骨架的变化, 旨在了解该益生菌对嗜水气单胞菌造成的肠道损伤的修复作用, 探讨益生菌对草鱼肠道的保护机制, 以期为该益生菌在防控草鱼肠道疾病的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

嗜水气单胞菌Ah1菌株: 分离自细菌性败血症银鲫, 可引起草鱼、银鲫、团头鲂、鲢等鱼类细菌性败血症和肠炎。将Ah1接种于LB液体培养基, 28℃振荡培养16—20h后离心收集, 用无菌的PBS调整菌悬液浓度为1.0×107cfu/mL备用。

枯草芽孢杆菌Ch9菌株: 分离自草鱼肠道。将Ch9接种于LB液体培养基, 37℃振荡培养24h后离心收集, 用无菌的PBS调整菌悬液浓度为1.0×107cfu/ mL备用。

以上菌株由华中农业大学水产学院水生动物医学实验室保存。

1.2 实验鱼及分组

实验用草鱼购于湖北省黄冈市百容水产良种有限公司, 平均体重为(70.0±5.0) g。暂养2周后开始实验, 整个实验期间保持微流水, 溶氧5—6 mg/L, pH约6.8, 每天投喂2次(10:00和16:00)海大707#草鱼饲料。

实验分3组, 分别为①对照组: 口灌无菌PBS 0.2 mL/尾后第2天、第4天分别口灌无菌PBS 0.1 mL/尾;②Ah组: 口灌嗜水气单胞菌菌液0.2 mL/尾后第2天、第4天分别口灌无菌PBS 0.1 mL/尾; ③Ah+Bs组: 口灌嗜水气单胞菌菌液0.2 mL/尾后第2和第4天分别口灌枯草芽孢杆菌菌液0.1 mL/尾; 每组设3个重复。口灌细菌的剂量参考文献[9]和预实验结果确定。实验鱼饲养于养殖系统中, 每个缸容积300 L,每缸20尾鱼。

1.3 取样及切片观察

每组于第2次口灌无菌PBS或枯草芽孢杆菌菌液前开始取样, 连续取样7d, 每次取样6尾鱼/组。实验鱼用鱼宝麻醉后剖开腹腔, 剥离肠系膜, 取中肠中部, 用无菌PBS清洗残余内容物后, 迅速将样品放入对应的固定液中固定12—24h后将样品修剪成需要大小, 更换新鲜固定液继续固定。

石蜡切片按常规方法, 多聚甲醛固定, 乙醇梯度脱水, 二甲苯透明, 切片厚度为5 μm; HE染色, OLYMPUS显微镜下观察、拍照。

超薄切片样品用2.5%戊二醛和1%锇酸固定,乙醇梯度脱水, 丙酮与环氧树脂渗透, 环氧树脂包埋, EM UC7型(Leica)超薄切片机切片, 厚度为60—100 nm, 经铀和铅双染色, Tecnai G220 TWIN型透射电镜下观察、拍照。

1.4 细胞骨架观察

参照文献[10]将石蜡切片经二甲苯、无水乙醇和蒸馏水脱蜡至水, 3% BSA室温封闭30min, 鬼笔环肽(Phalloidin)室温孵育2h, DAPI染液避光室温孵育10min, 切片用抗荧光淬灭封片剂封片。在OLYMPUS荧光显微镜下观察、拍照。

2 结果

2.1 益生芽孢杆菌对草鱼肠黏膜结构的保护作用

对照组草鱼在整个实验期间未见发病症状, 肠黏膜结构完整, 上皮层的淋巴细胞数量适度; 绒毛排列整齐(图 1A、1D)。

图 1 枯草芽孢杆菌对草鱼肠黏膜结构的影响(200×)Fig.1 Effects of B.subtilis on intestinal mucosal structure of C.idellus (200×)

Ah组在第1至第2天肠道黏膜上皮杯状细胞增多, 固有层可见出血; 第3天肠道解剖可见发红, 切片可见黏膜上皮细胞变性, 坏死、空泡化, 并可见脱落, 黏膜层内可见大量炎性细胞浸润, 肠绒毛缩短变粗(图 1B); 第5天鱼体两侧、鳍基有轻度充血,解剖可见肠壁红肿, 切片可见肠黏膜损伤程度大,肠道黏膜上皮细胞大量脱落, 杯状细胞增多, 肠腔内可见较多脱落的上皮细胞碎片和黏液, 固有层出血、水肿, 黏膜层内见大量炎性细胞浸润(图 1E);第6天后上述病变有所好转, 但仍可见黏膜上皮细胞脱落和炎症。

Ah+Bs组在第1至第2天肠道黏膜上皮杯状细胞增多, 固有层可见出血; 与Ah组相比, 第3和第5天肠道解剖可见轻度发红, 切片可见黏膜上皮细胞脱落、炎症等症状明显减轻, 第3天肠绒毛的基部可见轻微脱落现象, 固有层有少量出血(图 1C), 第5天肠绒毛的顶端和基部可见轻微脱落(1F); 与Ah组相比, 第7天黏膜上皮细胞脱落、炎症等症状也有明显改善。

2.2 益生芽孢杆菌对草鱼肠上皮细胞紧密连接与超微结构的保护作用

在透射电镜下, 肠上皮紧密连接结构为一条黑色的致密电子带, 起始于上皮顶端, 从绒毛根部向基底层延伸。对照组紧密连接结构整齐, 中间没有缝隙; 微绒毛密集且排列整齐, 可见微绒毛内有丝状的微丝束, 微丝束向胞质内延伸(图 2A); 肠上皮细胞核圆形或椭圆形, 核膜清晰; 胞浆内有较多的线粒体及内质网等, 线粒体为圆杆状, 嵴清晰(图 2D)。

Ah组(第4天)紧密连接结构严重受损, 缝隙明显变宽; 微绒毛萎缩变短, 稀疏, 排列紊乱; 微绒毛内的微丝束不清晰(图 2B); 肠上皮细胞核固缩, 体积变小有些甚至萎缩; 线粒体可见明显肿胀、嵴减少, 内质网明显扩张, 溶酶体增多(图 2E); 出现自噬现象。

Ah+Bs组(第4天)紧密连接结构损伤程度较小,缝隙明显变窄; 微绒毛数量多且排列较整齐(图 2C);线粒体数量增多, 结构完整, 无明显肿胀(图 2F)。

2.3 益生芽孢杆菌对肠上皮细胞微丝骨架的影响

在荧光显微镜下, 细胞核在紫外的激发下为蓝光, 微丝则为绿光。对照组肠上皮细胞中的微丝发出均匀的绿色荧光, 且荧光强度比较强(图 3A)。

Ah组部分肠上皮细胞中的微丝呈现绿色雾状, 尤其是在肠上皮细胞纹状缘处比较明显, 微丝斑点分布于细胞核周围, 第1至第4天肠上皮细胞中的微丝荧光强度逐渐减弱, 且第4天微丝荧光强度最弱, 明显低于对照组(图 3B); 第5天微丝荧光强度比第4天有所增强, 第6—7天微丝荧光强度较第5天略有减弱。

Ah+Bs组第1至第4天肠上皮细胞中的微丝荧光强度逐渐减弱, 第4天微丝荧光强度较Ah组略有增强(图 3C), 第6至第7天微丝荧光强度逐渐增强,均高于Ah组。

图 2 枯草芽孢杆菌对草鱼肠上皮细胞超微结构的影响(5000×)Fig.2 Effects of B.subtilis on ultrastructure of intestinal epithelial cells of C.idellus (5000×)

图 3 枯草杆菌对草鱼肠上皮细胞微丝骨架的影响(200×)Fig.3 Effects of B.subtilis on microfilament of intestinal epithelial cells of C.idellus (200×)

3 讨论

肠上皮的正常结构不仅是营养物质被充分消化吸收的基本保证, 也是发挥屏障功能和黏膜免疫反应的结构基础[11,12]。本实验给草鱼口灌嗜水气单胞菌后, 可见肠道有充血, 组织病理变化以肠上皮细胞变性、坏死, 出现不同程度的脱落现象为主,同时黏膜层内可见大量炎性细胞浸润和出血现象,这与相关的报道相似[13—15]。

芽孢杆菌能促进水生动物肠道的生长发育, 提高水生动物肠壁厚度、肠黏膜高度, 促使肠黏膜皱褶增多, 陷窝变深, 微绒毛长且密集, 肠道的吸收面积加大[6]; 但言研究枯草芽孢杆菌JS01对荧光假单胞菌感染鲤消化系统的变化, 结果发现枯草芽孢杆菌能改善感染鲤肠道发育, 肠总长、肠长指数和中肠皱褶高度显著提高, 从而提高感染鲤的消化和吸收能力[16]。给新生仔猪分别口灌枯草芽孢杆菌菌液、猪源乳酸杆菌菌液及这两种菌混合菌液, 并进行大肠埃希菌K88的攻毒实验, 结果表明这两种益生菌对肠道绒毛的发育起到了促进作用, 并能有效地拮抗大肠埃希菌K88对仔猪肠道上皮的损伤, 攻毒后的仔猪肠上皮形态结构基本正常, 没有炎性细胞浸润[17]。在本实验中, 补充一定剂量的枯草芽孢杆菌后, 感染嗜水气单胞菌的草鱼肠黏膜损伤程度有较大改善, 黏膜上皮细胞脱落、炎症和出血现象均有所减轻, 说明枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌造成的肠黏膜结构损伤有一定的修复作用, 对维持肠道的正常形态起到了重要的作用。

在本实验中, 感染嗜水气单胞菌的草鱼肠道超微结构变化为紧密连接缝隙明显变宽, 微绒毛萎缩变短、稀疏、排列紊乱, 线粒体可见明显肿胀、嵴减少, 内质网明显扩张等, 这些病理变化与该菌感染香鱼后的病理变化相似[18]。有研究表明, 乳杆菌能抑制致病性大肠杆菌对小鼠肠上皮细胞的损伤,维持肠上皮细胞结构完整和细胞间连接正常, 减轻微绒毛水肿现象, 细胞器无明显异常[19]; 患有结肠炎的大鼠经金双歧益生菌治疗后, 其肠上皮细胞的破坏得到很大恢复, 紧密连接结构及排列有明显改善[20]; 植物乳杆菌能改善急性胰腺炎引起的大鼠肠黏膜损伤, 维持肠上皮紧密连接结构的正常, 减少微绒毛的脱失[21]。本实验也得到了相似的结果, 给草鱼口灌枯草芽孢杆菌后, 紧密连接缝隙明显变窄,微绒毛数量多且排列较整齐, 表明枯草芽孢杆菌能有效地修复紧密连接结构和微绒毛形态。

微丝由肌动蛋白分子螺旋状聚合成, 正常生理状态下微丝在细胞质中成束状平行排列或疏散呈网状分布, 在细胞变形运动、肌肉收缩、有丝分裂、胞内物质运输等活动中有着必不可少的作用[22]。病原菌侵入时通常将细胞骨架作为主要的攻击目标, 尤其利用微丝做为跳板入侵宿主细胞并进行扩散和繁殖[23]。有研究报道, 嗜水气单胞菌对宿主细胞的侵袭过程首先是细菌通过其表面的黏附素与细胞表面受体发生作用, 接着就触发细胞中微丝微管的重排等一系列信号转导级联反应, 从而使细菌进入细胞内繁殖并产生胞外产物, 损害细胞[24]。在沙门氏菌与宿主细胞的接触面, 微丝会进行重排,从而使细胞膜发生皱缩, 有利于吞噬外面的细菌[25,26]。在本实验中嗜水气单胞菌感染后的肠上皮细胞中的微丝也发生了不同程度的解聚, 与上述结果类似。同时, 枯草芽孢杆菌能拮抗鼠伤寒沙门氏菌和产肠毒素大肠杆菌对Caco-2细胞中微丝的重排[27];乳酸菌可减轻侵袭性大肠杆菌感染Caco-2细胞后的TJ结构受损, F-actin的表达明显增多[28]; 乳杆菌能够抑制致病性大肠杆菌引起的肠上皮细胞微丝骨架的重排, 少量微丝骨架F-actin呈点状分布[19]。在本实验中枯草芽孢杆菌能抑制嗜水气单胞菌对肠上皮细胞中微丝的破坏, Ah+Bs组肠上皮细胞中的微丝荧光强度较Ah组有所增强, 说明枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌造成的肠上皮细胞中微丝的解聚起到了一定的修复作用。

微丝的解聚与重组和微绒毛的形态、肠上皮细胞间的紧密连接之间存在着结构和功能的关系。微丝的活动能促使一定量的胞质进出于微绒毛而有利于对物质的吸收[29]。在本实验中, 感染草鱼肠上皮细胞纹状缘处的微丝呈现绿色雾状尤为明显, 这与透射电镜图中看到的嗜水气单胞菌引起微绒毛中的微丝结构不清晰甚至消失的结果是一致的。由于失去内部支撑和定型的骨架, 大量指状的微绒毛可能因此松驰呈萎缩状或空泡状, 也可能是细胞在病原菌作用下发生水肿引起, 或者是两者共同作用的结果[30]。紧密连接(TJ)是肠上皮细胞间主要的连接方式, 能够维持上皮细胞极性及调节肠屏障的通透性。TJ膜内部分与肌动蛋白丝和肌球蛋白组成的近连接环直接相连[31,32]。近连接环能够控制细胞膜的收缩, 肌球蛋白的收缩可以对紧密连接膜内部分产生离心性的牵引, 进而调节紧密连接的渗透性[33]。在本实验中, 感染嗜水气单胞菌的草鱼肠上皮细胞中的微丝荧光强度逐渐减弱, 而口灌枯草芽孢杆菌后肠上皮细胞中的微丝荧光强度有所增强, 这与透射电镜图中看到的肠上皮细胞间紧密连接缝隙的变化结果相符。

综上所述, 在感染嗜水气单胞菌后, 草鱼肠道黏膜形态和肠上皮细胞微丝骨架会遭到一定程度的损伤, 口灌一定剂量枯草芽孢杆菌后, 肠黏膜损伤程度有较大改善, 说明枯草芽孢杆菌可修复嗜水气单胞菌造成的肠黏膜结构损伤, 对维持肠道的正常形态与功能起到了重要的作用。

[1]Zhang X J, Chen C Z, Fang H.Biological characterization and phylogenetic analysis of Aeromonas hydrophila from Ctenopharyngodon idellus [J].Chinese Journal of Zoonoses, 2006, 22(4): 334—337 [张晓君, 陈翠珍, 房海.草鱼肠炎嗜水气单胞菌分离株的主要特性及系统发育学分析.中国人兽共患病学报, 2006, 22(4): 334—337]

[2]Panigrahi A, Aezad I S.Mcrobial intervention for better fish health in aquaculture: the Indian scenario [J].Fish Physiology and Biochemistry, 2007, 33(4): 429—440

[3]Shen B Q, Chen J M, Guo J L, et al.Effect of adding Bacillus subtilis to diets on growth performance, digestive enzymes activity and body composition of fingerling black carp [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(1): 48—53 [沈斌乾, 陈建明, 郭建林, 等.饲料中添加枯草芽孢杆菌对青鱼生长、消化酶活性和鱼体组成的影响.水生生物学报, 2013, 37(1): 48—53]

[4]Simon M C.Bacilllus probiotics [J].Food Microbiology, 2011, 28(2): 214—220

[5]Yu M C, Li Z J, Lin H Z, et al.Effects of dietary Bacillus spp.and traditional Chinese medicines on growth and intestinal bacterial flora of shrimp Litopenaeus vannamei [J].Journal of Tropical Oceanography, 2010, 29(4): 132—137 [于明超, 李卓佳, 林黑着, 等.饲料中添加芽孢杆菌和中草药制剂对凡纳滨对虾生长及肠道菌群的影响.热带海洋学报, 2010, 29(4): 132—137]

[6]Luo H, Zhou J, Ye H.Effects of probiotics on structure and activity of digestive enzymes in intestine tracts in fish [J].Fisheries Science, 2006, 25(2): 105—108 [罗辉, 周剑, 叶华.微生态制剂对鱼类肠道结构和消化酶活性的影响.水产科学, 2006, 25(2): 105—108]

[7]Qu Y, Cai C F, Dai X F, et al.Effects of Bacillus subtilis on growth performance and intestinal mucosal morphology of Ctenopharyngodon idellus [J].Chinese Feed, 2010, 19: 34—36 [邱燕, 蔡春芳, 代小芳, 等.枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能与肠道黏膜形态的影响.中国饲料, 2010, 19: 34—36]

[8]Liu K L, He M Q.Study on the effect of probiotics on immune function of common carp (Cyprinus carpio) [J].Feed Industry, 2000, 21(6): 24—25 [刘克琳, 何明清.益生菌对鲤鱼免疫功能影响的研究.饲料工业, 2000, 21(6): 24—25]

[9]Wu Z X, Feng X, Xie L L, et al.Effect of probiotic Bacillus subtilis Ch9for grass carp, Ctenopharyngodon idella (Valenciennes, 1844), on growth performance, digestive enzyme activities and intestinal microflora [J].Journal of Applied Ichthyology, 2012, 28(5): 721—727

[10]Zhuang Y G.Regulation of actins microfilament on pulmonary epithelial tight junctions in rat with acute lung injury [D].Thesis for Master of Science.Southeast University, Nanjing.2005 [庄育刚.肌动蛋白微丝对急性肺损伤大鼠肺泡上皮紧密连接影响的实验研究.硕士学位论文, 东南大学, 南京.2005]

[11]Magalhaes J G, Tattol I, Girardin S E.The intestinal epithelial barrier: How to distinguish between the microbial flora and pathogens [J].Seminars in Immunology, 2007, 19(2): 106—115

[12]Oswald I P.Role of intestinal epithelial cells in the innate immune defence of the pig intestine [J].Veterinary Research, 2006, 37(3): 359—368

[13]Zhan W B.Aquatic Animal Diseases (The second edition) [M].Beijing: Chinese Agriculture Press.2011, 130—132 [战文斌.水产动物病害学 (第二版).北京: 中国农业出版社, 2011, 130—132]

[14]Song X H, Zhao J, Bo Y X, et al.Aeromonas hydrophila induces intestinal inflammation in grass carp (Ctenopharyngodon idella): An experimental model [J].Aquaculture, 2014, 434: 171—178

[15]Zhao F Q, Cao J L, Liu Q.Study on pathology and etiology of hemorrhagic septicemia in Acipenser baerii [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(2): 316—323 [赵凤岐, 曹谨玲, 刘青.西伯利亚鲟败血症病理学观察与病原学研究.水生生物学报, 2009, 33(2): 316—323]

[16]Dan Y.Effects of Bacillus subtilis JS01 on digestive ability and immune function of common carp (Cyprinus carpio) infected by A.hydrophila [D].Thesis for Master of Science.Sichuan Agricultural University, Chengdu.2011 [但言.枯草芽孢杆菌JS01对荧光假单胞菌感染鲤免疫和生长性能的影响.硕士学位论文, 四川农业大学, 成都.2011]

[17]Deng J, Li Y F, Yang Q.Effects of Co-Administration of Bacillus subtilis and porcine Lactobacillus salivarius on intestinal villus of piglets [J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2013, 44(2): 295—301 [邓军, 李云锋,杨倩.枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌混合饲喂对仔猪肠绒毛发育的影响.畜牧兽医学报, 2013, 44(2): 295—301]

[18]Li M Y, Zhang C N, Miao L, et al.Histopathological changes in main target organs of AYU (Plecoglossus altivelis) infected with Aeromonas hydrophila [J].Journal of Ningbo University (NSEE), 2011, 3: 1—4 [李明云, 张呈念, 苗亮, 等.香鱼嗜水气单胞菌染病后主要靶器官组织病理学观察.宁波大学学报(理工版), 2011, 3: 1—4]

[19]Wang B.Screening of adhesive activity of Lactobacilli and preliminary study on potential mechanisms of binding to enterocyte - like HT - 29 Cells [D].Thesis for Doctor of Science.Third Military Medical University.2005 [王斌.高黏附性能乳杆菌的筛选及其对肠上皮细胞黏附机制的初步研究.博士学位论文, 第三军医大学.2005]

[20]Wang H Y.Role of the probiotics protecting tight junction Claudin-1 protein of the epithelial cells in rats with trinitro-benzen-sulfonic acid induced colitis [D].Thesis for Master of Science.North Sichuan Medical College, Chengdu.2013 [王海燕.益生菌对TNBS诱导大鼠结肠炎肠黏膜上皮细胞紧密连接Claudin-1蛋白保护作用的研究.硕士学位论文, 川北医学院, 成都.2013]

[21]Qin H L, Su Z D, Fan X B, et al.Effects of probiotics on gut microflora and barrier function of rats with acute pancreatitis [J].Chinese Journal of Clinical Nutrition, 2006, 14(2): 82—86 [秦环龙, 苏振东, 范小兵, 等.益生菌对急性胰腺炎大鼠肠道微生态及紧密连接的影响.中国临床营养杂志, 2006, 14(2): 82—86]

[22]Plastino J, Sykes C.The actin slingshot [J].Current Opinion in Cell Biology, 2005, 17(1): 62—66

[23]Yang Q.The assembly between pathogenic bacteria and microfilament of the host cell [J].Chinese Journal of Cell and Molecular Immunology, 2010, 26(1): 96—98 [杨倩.病原菌与宿主细胞中的微丝装配.细胞与分子免疫学杂志, 2010, 26(1): 96—98]

[24]Chu W H, Lu C P.Invasion of Aeromonas hydrophila in cells involving signal transduction and cytoskeleton [J].Acta Microbiologica Sinica, 2003, 43(6): 817—820 [储卫华, 陆承平.嗜水气单胞菌侵袭力与宿主细胞信号转导和骨架的关系.微生物学报, 2003, 43(6): 817—820]

[25]Patel J C, Rossanese O W, Galan J E.The functional interface between Salmonella and its host cell: opportunities for therapeutic intervention [J].Trends Pharmacology Science, 2005, 26(11): 564—570

[26]Tafazoli F, Magnusson K E, Zheng L.Disruption of epithelial barrier integrity by Salmonella enterica serovar typhimurium requires geranylgeranylated proteins [J].Infection and Immunity, 2003, 71(2): 872—881

[27]Ye X L, Li P C, Yang Q.Effects of Bacillus subtilis against pathogens on actin filament [J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2011, 42(8): 1150—1154 [叶小兰,李鹏成, 杨倩.枯草芽孢杆菌拮抗病原菌对细胞微丝的影响.畜牧兽医学报, 2011, 42(8): 1150—1154]

[28]Yang J, Zhang Z W, Qin H L.Protective role of Lactobacillus plantarun in regulating intestinal epithelial cells response to pathogenic bacteria [J].World Chinese Journal of Digestology, 2008, 16(30): 3394—3399 [杨俊, 张中伟, 秦环龙.乳酸菌对肠上皮细胞侵袭性大肠杆菌损伤的保护作用.世界华人消化杂志, 2008, 16(30): 3394—3399]

[29]Fang H L, Zeng W Z.Studies on ultrastructure and histochemistry of the intestine of Tilapia nilotica L [J].Journal of Guangxi Agricultural University, 1992, 11(3): 121—126 [房慧伶, 曾文宗.尼罗罗非鱼肠道的细微结构及组织化学的研究.广西农业大学学报, 1992, 11(3): 121—126]

[30]Gao J K.Effects of porcine epidemic diarrhea virus influenced the microfilament cytoskeleton and the tight junctions [D].Thesis for Master of Science.Nanjing Agricultural University, Nanjing.2013 [高君恺.猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响.硕士学位论文, 南京农业大学, 南京.2013]

[31]Radhakrishna H, Klausner R D, Donaldson J G.Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the arf6 gtpase [J].Journal of Cell Biology, 1996, 134(4): 935—47

[32]Mercer J, Helenius A.Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells [J].Science, 2008, 320(5875): 531—535

[33]Charrras G T, Hu C K, Coughlin M, et al.Reassembly of contractile actin cortex in cell blebs [J].Journal of Cell Biology, 2006, 175(3): 477—490

THE PROTECTIVE EFFECT OF PROBIOTIC BACILLUS ON THE INTESTINAL MUCOSAL STRUCTURE OF CTENOPHARYNGODON IDELLUS

HUANG Can1, ZHANG Zhong-Hai1, WU Shu-Qin2, ZHANG Ding1, LI Si-Si1, CHEN Xiao-Xuan1and WU Zhi-Xin1
(1.Key Lab of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Hubei Provincial Engineering Laboratory for Pond Aquaculture, Fisheries College of Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2.Pearl River Fisheries Research Institute, CAFS, Guangzhou 510380, China)

To study the protective effect of probiotics on the intestinal mucosal structure of C.idellus, the protective role of Bacillus subtilis on the intestinal mucosal structure damage by Aeromonas hydrophila infection in C.idellus were randomly divided into three groups: ① The control group: each fish was firstly orally administrated with 0.2 mL of aseptic phosphate buffer solution, and then orally administrated with 0.1 mL of aseptic Phosphate Buffer solution at day 2 and 4; ② The Ah group: each fish was firstly orally administrated with 0.2 mL of isotonic saline suspension containing A.hydrophila (1.0×107cfu/mL), and then orally administrated with 0.1 mL of aseptic phosphate buffer solution at day 2 and 4; ③ The Ah+Bs group: each fish was firstly orally administrated with 0.2 mL of isotonic saline suspension containing A.hydrophila, and then orally administrated with 0.1 mL of isotonic saline suspension containing B.subtilis (1.0×107cfu/mL) at day 2 and 4.Middle portion of midgut were collected every day for 7 days to observe intestinal mucous morphology and microfilament cytoskeleton of epithelial cells of C.idellus.The results showed that the pathological characters in the Ah group mainly included degeneration, necrosis and shedding of the intestinal epithelial cells, hemorrhage, edema and thicker of the lamina propria.A large number of inflammatory cells were infiltrated and gap of TJ widened obviously.Microvilli became short, sparse and disorder.Mitochondria became obviously swollen and crest reduced, and endoplasmic reticulum expanded.Microfilament of intestinal epithelial cells appeared green vaporous, and the fluorescence intensity of microfilament gradually weakened, which were significantly lower than that in the control group.The B.subtilis reduced damages of intestinal mucosal, including intestinal mucosa slightly shed; hemorrhage and inflammation phenomenon significantly reduced; Gap of TJ obviously narrowed; the number of microvilli increased; the microvilli arranged regularly; mitochondria had no obvious swelling.The fluorescence intensity of microfilament in the Ah+Bs group was higher than that in the Ah group.The results indicated that B.subtilis reduce the structural damage of intestinal mucosal by A.hydrophila infection.

Probiotic Bacillus subtilis; Aeromonas hydrophila; Ctenopharyngodon idellus; Intestinal mucosal; Microfilament cytoskeleton

S963.73

A

1000-3207(2017)04-0774-07

10.7541/2017.96

2016-07-25;

2016-11-26

国家自然科学基金(31472310)资助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31472310)]

黄灿(1991—), 女, 湖北黄冈人; 硕士研究生; 主要研究方向为鱼类病理与免疫。E-mail: 15927649685@163.com

吴志新(1962—), 女, 湖北武汉人; 教授; 主要从事鱼类病理与免疫。E-mail: wuzhixin@mail.hzau.edu.cn