甜柿幼胚抢救体系优化研究

徐 阳, 龚榜初, 吴开云, 江锡兵, 刘同祥, 汤 丹, 孙维敏, 马 攀， 滕国新

(1. 中国林科院 亚热带林业研究所 浙江省林木育种技术研究重点实验室， 杭州 311400； 2. 浙江省兰溪市苗圃， 金华 321100)

甜柿幼胚抢救体系优化研究

徐 阳1, 龚榜初1, 吴开云1, 江锡兵1, 刘同祥1, 汤 丹1, 孙维敏1, 马 攀1， 滕国新2

(1. 中国林科院 亚热带林业研究所 浙江省林木育种技术研究重点实验室， 杭州 311400； 2. 浙江省兰溪市苗圃， 金华 321100)

柿杂种败育现象严重阻碍了甜柿杂交育种进展，幼胚抢救技术可有效地克服这个障碍。以甜柿富有、晚御所、太秋的幼胚为材料，开展培养基、柿品种、取胚时间4因素3水平正交试验。并在此基础上，以太秋幼胚为材料，开展了取胚时间、培养基成分的单因素试验。结果表明：1)影响柿幼胚抢救的因素影响依次为培养基、取胚时间、柿品种、培养条件；2)花后45～55 d取胚抢救，胚苗成苗率极低，此后，随着胚龄增大，胚培苗成活率逐渐提高，但花后77 d取胚时，胚苗成苗率略有回落，因此长三角地区柿幼胚抢救的最适取胚时间为：花后62～69 d；3)胚苗在不同培养基中的发育状态、成苗率、苗高、生根数上均出现差异，1/2MS+ZT(0.4 mg/L)+ IBA(0.2 mg/L)+活性炭(3 g/ L)+蔗糖(70 g/ L)培养基中培苗发育良好，培养45 d后，成苗率为0.88，平均苗高为3.52 cm，平均生根数为2.52。

甜柿；幼胚抢救；取胚时间；培养基

甜柿(DiospyroskakiThunb)风味好，具有良好的生态效益和经济效益，一年种植多年受益，是山区脱贫致富的重要树种[1]。自20世纪80年代以来, 多家科研单位系统地开展了甜柿引种[2-3]、高效栽培[4]、砧木选育[5-8]、杂交育种[9-10]、示范推广[11]等工作。目前甜柿在中国20多个省市有栽培，面积15万～20万亩，每年不断扩大，其中长三角地区是甜柿发展最有活力的地区之一[1, 12]。

柿新品种培育对柿未来发展至关重要，目前杂交育种是甜柿最重要的育种手段[12]，但柿为多倍体，柿种发育存在中途败育现象[13-14]，且在优良杂交组合中表现更为严重；同时个别品种在种胚未成熟前存在生理落果现象[15]。采用常规播种时，这些种胚发育不全的柿种不能成苗或萌芽率很低。磨盘柿(D.kakiThunb ‘Mopanshi’)、晚御所(D.kakiThunb ‘Okugosho’)、太秋(D.kakiThunb ‘Taishu’)等常用育种亲本本身结籽率低，无形中也增加了杂种获取难度。杂种获取困难，已严重阻碍了甜柿育种进展，导致目前我国优新甜柿品种更新缓慢，缺乏自主品种权的甜柿[12]。

未成熟胚抢救技术，可使可能败育或退化的胚经过适宜培养，获得再生[16]。目前该技术在次郎(D.kakiThunb ‘Jirou’)、罗田甜柿(D.kakiThunb ‘Luotiantianshi’)和磨盘柿杂交育种中得到了初步尝试和应用[17-20]，但未见该技术在太秋等甜柿幼胚抢救中成功应用的报道。同时已报道的各技术方案中，培养条件、取胚时间、培养基组成等环节上存在较大差异，如：我国武汉地区次郎甜柿幼胚抢救时间为花后50～60 d[20]，而日本的次郎甜柿，多在花后70 d进行胚抢救[17]；磨盘柿利用添加6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤)的培养基进行幼胚抢救，而罗田甜柿的幼胚培养基中则添加ZT(Zeatin，玉米素)，这些差异的存在不利于其他地区柿杂交育种应用时进行参考。据此，本试验以中国长三角地区常用柿育种亲本为材料，开展幼胚抢救系统优化研究，以期为本地区柿胚培养提供精确、可靠的参考，并进而完善柿幼胚抢救技术体系，从而加快柿育种进程。

1 材料与方法

1.1 幼胚培养因素的正交试验

为确定柿幼胚抢救体系中的关键影响因素，本文设立了培养基、柿品种、取胚时间(DAP, Days after pollination)4因素3水平正交优化试验(表1)。其中，培养基以MS(Murashige and Skoog培养基)+5%蔗糖+8 g/L琼脂为基本培养基。在此基础上，另设置两种激素处理 [Zt (0.4 mg/L)、IBA(3-indolebutyric acid，3-吲哚丁酸)(0.3 mg/L)]。富有、晚御所、太秋为该地区甜柿育种中常用亲本代表；以恒温24℃、光照14 h为基础培养条件，另设置了两个培养条件处理 [先暗培养4 d后转入基础条件下培养、在培养基中加入活性炭(3 g/L)]。各组合培养基pH值调至5.8, 高压灭菌备用。每组合接种30个幼胚, 重复3次。

表 1 甜柿幼胚抢救正交设计

1.2 幼胚取胚时间优化

以太秋甜柿为材料，分别于花后40、47、55、62、69和77 d取胚，进行幼胚类型观测，每时间点观察30～50个幼胚。分别以正交试验中1号和2号培养基进行各时间点的幼胚培养，比较不同取胚时间对幼胚抢救培养的影响，每个取胚时间接种30～50个幼胚。

1. 3 培养基优化

根据以往研究经验和正交试验结果，本试验中设计了6种培养基(表2)，以太秋甜柿65 DAP的幼胚为材料进行培养，每7 d观察各培养方案中幼胚发育状态。

1. 4 试验方法

幼果用自来水冲洗, 再用70%酒精浸泡30 s, 然后用1%次氯酸钠(加入2～3滴Tween20)浸泡10 min, 无菌水冲洗3～4次。在无菌条件下剥取幼胚接种于各种培养基中。在恒温28℃、光照14 h、光照强度31.2～39.0 μmol/m2·s的条件下培养。

表 2 用于幼胚培养试验的6种培养基

1. 5 数据分析

所有接种处理分别于14 d后统计幼胚萌发率，45 d后统计成苗率及株高。数据分析采用SPSS分析软件。

2 结果

2.1 正交试验判定影响因素

分别于两周后和两个月后统计各实验处理中幼胚萌发率及成苗率，并进行正交分析。R值的大小反映了各因素对萌发率、成苗率影响的大小。由表3可知，相对于成苗率，萌发率受实验因素的影响程度较大些。各因素中，影响幼胚萌发率和成苗率程度的因素排名基本一致，排名为：培养基>取胚时间>柿品种>培养条件。但K值显示理论上最优组合并未出现在实验设置中。因此有必要以太秋幼胚为材料，对培养基构成和取胚时间进行单因素试验，从而确定出柿幼胚培养的最佳培养体系。

2.2 取胚时间筛选

各时间点柿胚类型观测结果(表4)表明，柿杂种胚在40 DAP时多为球形胚；47 DAP时柿胚以心形胚为主，尚有一部分胚发育缓慢，仍为球形胚；55 DAP时，多数胚发育成鱼雷胚；62 DAP以子叶胚为主，但存在部分鱼雷胚；69～77 DAP，柿胚多为子叶胚，且69 DAP后新增子叶胚比例变缓；总体上与扈惠灵和徐莉清等柿胚观测基本一致[20-21]。

表3 幼胚抢救培养正交试验结果分析

表 4 不同取胚时间下各类型胚发生率

柿胚在球形胚和心形胚时期，较难进行观测与胚分离操作，40及47 DAP时，本实验采用幼种培育，其他时间段采用幼胚培养方式。如图1所示，无论是1号培养基还是2号培养基，此阶段胚培养成功率均很低，如40DAP，成苗率分别为3.6%和2.6%；花后47 d取胚，两个培养基中胚培苗成苗率仍不超过10%；到第55天后，两种培养基的胚培苗成苗率都显著提升，成苗率达到40%～60%左右；此后，随着胚龄增大，成活率逐渐提高，第62 DAP时，成苗率达到50%～70%；花后69 d取胚时，两种培养基中胚培苗成苗率都达到最高；然而，到77 DAP取胚时，成苗率略有回落。

2.3 柿幼胚抢救技术的培养基组分筛选

正交试验表明，在胚挽救中最关键的问题是寻找一种合适的培养基。其中，无激素的基本培养基中，胚培苗萌发率、成苗率都在较低水平；在培养基中添加IBA后，胚培苗各指标都得到了提升，特别是生根数显著提升；而添加ZT的培养基中胚培苗萌发率、成苗率、成苗效率显著高于其他培养基，但生根数显著低于其他两种培养基，可见ZT和IBA在柿幼胚培养中都发挥着作用。据此下面试验根据预试验与前人研究结果，共选用与设计6种培养基用于培养基优化筛选试验。

表 5 正交试验中不同培养基的胚培苗生长情况

图1 不同取胚时间对幼胚抢救成苗率的影响

Fig 1 Effect of different embryo-collecting time on seedlings rate of persimmon immature embryo culture

图2 幼胚培养各发育历程情况总览Fig 2 The overview of different embryos-seedling development course

各培养基中，接种4 d后，幼胚变得饱满，胚轴开始伸长，胚轴底部出现蓝色分泌物。但部分胚到接种70 d后也无变化，视为“死苗”(见图2)。接种7 d后，胚轴明显伸长，且颜色变黑，明显出现根组织，子叶逐渐平展开，颜色开始转绿。接种14 d后，出现了不同的发育历程，其中，有部分胚培苗的根“腾空生长”，茎、叶并无明显增大，呈现出“跳苗”现象(如图2中历程2)，且“跳苗”状态一直维持；一些胚培苗茎部迅速伸长且粗大，颜色翠绿，而子叶发育迟缓，且出现明显“黄化”现象，到接种30 d后，子叶才开始正常发育(如图2中历程3)；一部分正常发育，根、茎、叶发育协调(如图2中历程4)；另培养时，还出现发育历程5(见图2)，即接种14 d后，子叶迅速膨大、平展、颜色墨绿，根、茎发育迟缓。具有历程3、4和5的胚培苗在接种60～70 d后最终均能呈现正常苗。此外，又有部分胚培苗整体发育迟缓，20 d后，幼胚才呈现进一步发育状态，到100 d后，才逐渐发育成苗，但各部分发育协调(如图中历程6)。

如表5、6与图3显示，各培养基胚培苗在发育历程、成苗率、苗高及生根数均出现差异。无激素添加的MS培养基，幼胚发育迟缓，以发育历程6为主，成苗率、苗高、生根数等显著低于其他培养基。添加激素ZT的1、2和3号培养基中胚培苗发育启动早，历程4的胚培苗比率显著高于其他培养基。但只添加高浓度ZT的培养基，胚培苗生根数为各培养基中最低。而配合使用激素ZT和IBA的培养基幼胚抢救培养效果较好，其中1号与2号培养基中幼胚成苗率、生根数指标都显著高于其他培养基，苗高也显著高于5、6号培养基。且2号培养基中胚培苗发育较为均衡，具有发育历程3、4和5的胚培苗总比率最高，为0.92。1/2N(1号、2号培养基)和3/4NMS(4号培养基)的中“跳苗”比率高于其他培养基。

表6 不同培养基下幼胚成活率、苗高和生根数

由上述试验可以确定，在长三角地区进行柿幼胚抢救最佳方案为：62～69 DAP取胚，采用[1/2MS+ZT(0.4 mg/L)+ IBA(0.2 mg/L)+活性炭(3 g/ L)+蔗糖(70 g/ L)]培养基，胚培苗发育良好(如图4-a)，培养45 d后，成苗率为0.88、平均苗高为3.52 cm、生根数平均为2.52，此时进行炼苗、移栽，移栽30 d后成活率在85%以上(图4-b)。

图3 各培养基中幼胚发育情况分布比率

图4 2号培养基中胚苗培育与移栽情况

a:培养45 d后的胚培苗；b:移栽30 d后的幼苗

3 讨论

柿种发育过程中存在普遍而严重的胚早期退化现象，极大地降低了育种效率[12, 18-19]。通过胚抢救技术，可使败育或退化的柿幼胚，获得再生，从而提高育种效率[16]。然而，植物胚拯救过程中影响因素有很多，本试验对甜柿幼胚抢救体系中主要影响因素进行正交分析。与多数植物一样[22-24]，本文正交试验显示培养基成分和胚龄也是甜柿幼胚抢救体系中主要影响因素。

3.1 取胚时间

理论上，在柿胚发育早期进行胚抢救，可最大限度获得柿种质，但本试验与磨盘柿[21]及次郎[20]的幼胚培养都显示，40～47 DAP的幼胚成苗率都较低，这也与毛桃(AmygdaluspersicaBatsch)[25]、甜瓜(Cucumismelo)[26]、百合(Liliumbrownii)[27]等多种植物难以在球形胚和心形胚阶段建立幼胚抢救体系的结论一致。许多研究表明[20- 21, 26]，幼胚抢救成功率与胚发育状态密切相关。植物胚动态发育是一个由异养阶段向自养阶段逐渐转化的过程，异养阶段的幼胚难以培养，而始于心形胚发育后期的自养植物幼胚则较容易培养[24]。同样，本试验中，采用55 DAP时鱼雷胚进行抢救，胚培苗成苗率显著提升，此后随着胚龄增大，胚逐渐进入子叶胚，成活率与成苗率都逐渐提高，这也与桃(Amygdaluspersica)、杏(Armeniacavulgaris)、李(Prunussalicina)和梅(Armeniacamume)等成苗率与胚龄正相关的结论[22, 24]相一致。而本实验显示，77 DAP的胚成苗率略有回落，可能此时幼胚过度成熟，胚细胞生长分裂能力已大大下降，甚至已启动休眠系统[28]，不适宜胚培养；又或是由于此时胚乳硬化，取胚时易对胚产生机械损伤，影响胚活力；虽其根本原因尚未明确，但与传统柿幼胚培养极少采用花后80 d的幼胚进行胚培养的操作处理[17-19]相吻合。

综合各取胚时间幼胚培养效果，本文表明花后62～69 DAP为柿幼胚培养最佳取胚时间。与日本的次郎[17]、中国的北京磨盘柿[19]以及武汉罗田甜柿[18]等研究中采用70 DAP时进行胚抢救相比，本文的胚抢救时间提前了1周左右，增大了柿杂种获得率的同时也节约了育种时间；而与冷平等认为花后60～80 DAP为北京地区磨盘柿胚培养的最佳时期[21]相比，本文为柿胚抢救提供了更为精细的取胚参考时间。以往研究表明由于柿胚发育的地域性差异，同品种柿的最适取胚时间在各地有别，如徐莉清等研究表明武汉地区次郎甜柿幼胚抢救时间为花后50～60 DAP[20]，而日本地区的次郎甜柿，多在70 DAP时进行胚抢救[17]，这也暗示了中国浙北、皖南、苏南等长三角区域的甜柿育种中，采用本试验取胚时间进行幼胚抢救，相对其他研究中的取胚时间更为适宜。

3.2 培养基成分

本文正交试验及以往试验表明，柿胚挽救关键是合适培养基的配置。细胞分裂素和生长素在植物幼胚培养中起到主要作用[22-24]，而浆果类水果胚培养实验中，细胞分裂素常用ZT或6-BA，生长素常使用IBA或IAA[24, 26]。柿组织培中较低的氮浓度，培养效果较好[29-30]。柿组培中培养基存在褐化问题，需要在培养基中增加了还原剂或吸附剂[18-19]。据此本实验设计了6种培养基进行幼胚培养试验。

与6-BA能有效地打破的葡萄(Vitisvinifera)胚早期发芽[31]不同的是，本实验中添加ZT培养基中的柿胚发育启动明显早于其他培养基，这与多数研究者认为ZT是柿胚萌发启动中关键因子的结论相一致[17-18]，也与柿组培中培养基中ZT效果好于6-BA的结论相一致[32-33]。虽然没有添加激素的5号培养基在Sugiura[33]和朱伟玲[34]胚培养研究中取得了较好的结果，但在本文中幼胚发育缓慢，且成苗率及苗高较低。笔者推测Sugiura试验中前期体胚诱导培养基中含有大量ZT，致使用于幼胚培养的体胚中残留大量ZT，以致在无ZT的培养基中也能取得较好的培养效果。而朱伟玲在试验中采用的是花后180～200 DAP成熟胚，胚发育启动已经完成了。这些也从侧面说明了ZT在幼胚萌发启动中的重要作用。但较高ZT浓度，对柿生根存在不利影响，如本文中只添加较多ZT的6号培养基中，胚发育虽然启动正常，但成苗率和苗高较低，这也可能是根和茎段发育缺少生长素参与，在培养中需添加生长素。据此，本试验中比较了IBA和IAA的效果，结果表明IBA的使用下，柿胚成苗率、苗高、培养效果均显著高于添加IAA的培养基，同时也好于没有生长素的培养基。

柿组培中，由于次生代谢产物较多，培养基容易褐化。本试验表明，添加活性炭的效果好于PVP，这也与谷晓峰的柿培养结果相一致[18]。较低氮源，虽有利于柿胚发育，但本文在1/2N和3/4NMS的培养过程中存在一定比率跳苗的现象，和磨盘柿幼胚试验结果相似[35]；反而本文在1/2MS培养基下，大量元素间比例可能较为均衡，胚培养中较少出现跳苗现象，胚苗各器官发育较为均衡。故综合各方面培养效果表现，本课题组选择2号培养基作为幼胚抢救培养基，培养45 d后，成苗率与传统柿幼胚培养相当，而平均苗高、生根数等指标高于传统柿幼胚培养研究[18-21, 35]。

针对长三角地区柿育种中幼胚抢救缺乏直接的技术参考，本文以该地区常用育种亲本为材料，开展正交与单因素试验。试验结果表明：该地区柿胚抢救宜于62～69 DAP取胚，采用1/2MS+ZT(0.4 mg/L)+IBA(0.2 mg/L)+活性炭(3 g/ L)+蔗糖(70 g/ L)为培养基进行幼胚培养。这一结果为该地区的柿育种工作提供了良好的技术基础。

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Optimization of immature embryo rescue technique system for persimmon

XU Yang1, GONG Bang-chu1, WU Kai-yun1, JIANG Xi-bing1, LIU Tong-xiang1, TANG Dan1, SUN Wei-ming1, MA Pan1， TENG Guo-xin2

(1. Key Laboratory of Tree Breeding of Zhejiang Province, Research Institute of subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou 311400; 2. Plant Nursery of Lanxi Citry in Zhejiang Province, Jinhua 321100, China)

The high percentage of abnormal seeds during the growth of its hybrid seriously hampered the development of the persimmon cross-breeding research. The technique of immature embryo rescue could rescue abortive embryos to obtain hybrid seedlings. The immature embryo ofD.kakiThunb ‘Fuyu’,D.kakiThunb ‘Okugosho’,D.kakiThunb ‘Taishu’ was used as the experimental materials, an orthogonal experiment of L9(34)was adopted to study for embryo rescue. Then, using the immature embryo ofD.kakiThunb ‘Taishu’as the experimental materials, media and embryo-collecting time were respectively determined as univariate factor for further single factor experiment. The results showed that according to the effect on immature embryo rescue,the order for the factors was as follows: media, embryo-collecting time, persimmon varieties, and cultivation conditions. The seedling rates of embryos from 45 days after pollination (DAP) to 55 DAP were extremely low. Though, the embryo culture seedling rates increase as embryo age increased. The seedling rates of embryo from 77 DAP dropped slightly. So, the optimal embryo-collecting time for persimmon immature embryo rescue in the lower area of the Yangtze River is: 62-69 DAP. An extensive variation existed in the development process, embryo seedlings rate, seedling height and root number of persimmon immature embryo in different medium. By comparative analysis, the optimal medium for persimmon immature embryo rescue is 1/2 MS+ZT (0.4 mg/L) + IBA(0.2 mg/L)+Activated carbon (3 g/L)+Sucrose (70 g/L). After cultivating for 45 days, the average seedlings rate, average seedling height and average root number of persimmon immature embryo can, be up to 0.88, 3.52 cm and 2.52 respectively.

persimmon; immature embryo rescue; embryo-collecting time; medium

2016-08-30；

2016-09-08

“十二五”科技计划课题“涩柿和甜柿高效生产关键技术研究与示范”(2013BAD14B05)；国家林业局948项目(2013-4-26)；浙江省科技厅十三五果品农业新品种选育重大科技专项“柿枣新品种选育”课题(2016C02052-10)

徐 阳，博士，助理研究员，研究方向为经济林良种选育与高效栽培，E-mail：xuyang198610@163.com

龚榜初，研究员，研究方向为经济林良种选育与高效栽培，E-mail：gongbc@126.com

S665.2

B

2095-1736(2017)04-0110-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.110