骨髓间充质干细胞提取培养分化鉴定

王可新，姚宏波，王 硕，刘子墨，廉 洁*

（齐齐哈尔医学院基础医学院，1.卓越1班，2.组胚教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

1 实验材料及仪器

1.1 一般资料

SD级大鼠、DMEM培养基、Hanks液、20%完全培养基、双抗、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和链霉素、EDTA溶液

1.2 仪器

倒置显微镜、培养瓶、眼科镊、眼科剪、二氧化碳培养箱、离心机、超净工作台、离心管、培养瓶、玻璃吸管、胶帽、注射器、小烧杯、细胞培养板

2 实验方法

2.1 细胞的提取与培养

（1）取大鼠脱颈处死，浸泡于75%的乙醇溶液中20～30 min，无菌洁净工作台上，取大鼠双侧后肢股骨，置入小烧杯中，用适量Hanks液清洗2～3次，洗去血污。

（2）用眼科剪剪开两端骨骺，暴露骨髓腔，一端置于离心管上方，另一端用注射器抽取Hanks液注入骨髓腔，冲出骨髓。反复冲洗至液体不再浑浊为止。离心10分钟，骨髓下沉，用吸管吸出多余的Hanks液。

（3）用培养液清洗1次，加入20%培养液5 mL，放入培养瓶，置于37℃5%二氧化碳培养箱。

（4）第二日换液，观察细胞贴壁情况。以后每3～4天更换培养基一次，当细胞融合80%～90%时，按1：2进行传代培养。

（5）利用倒置显微镜下分别对原代培养的细胞和传代培养的细胞进行观察，观察其生长特点。

（6）利用HE染色法对细胞进行染色，光镜下观察大鼠骨髓间充质干细胞的形态特征。

2.2 细胞的换液方法：

（1）37℃水浴中放入PBS及10%培养液，10分钟。

（2）操作台及实验室内紫外照射20-30分钟。

（3）紫外结束，开排风，点酒精灯，戴好手套，用酒精棉球擦拭工作台及手。

（4）取出培养瓶，用酒精棉球擦拭培养瓶瓶口、体及底。

（5）在操作箱中，打开培养瓶，过火，倒掉培养液。

（6）PBS、培养液打开封口膜，过火，注射器分别插入瓶口。

（7）用PBS冲洗2次，加入5毫升培养液，盖好瓶盖，放入培养箱。

（8）将PBS、培养液封口膜封口，放入4℃冰箱。

2.3 细胞的传代培养：

（1）待原代细胞长到80%-90%，细胞状态接近融合时，于此时进行细胞的传代培养。

（2）无菌条件下，在经过紫外线杀菌后的操作台内，倒掉培养瓶中的旧培养液。

（3）Hanks液清洗培养瓶1-2次后，向其中加入1毫升胰蛋白酶和EDTA混合液（体积比为1:1），盖好瓶盖盖，放置于37℃培养箱中温育2-4分钟。

（4）显微镜下观察，若细胞回缩，细胞间隙变大，甚至漂浮起来，此时需立即停止消化。

（5）轻轻吸除消化液，加Hanks液清洗培养瓶1次，去除残存的消化液。

（6）向培养瓶中加入培养液2毫升，用吸管反复吹打贴壁细胞，制成细胞悬液。

（7）用计数板计数悬液浓度约10^5/ml接种于新培养瓶中。

2.4 细胞的分化诱导鉴定：

（1）取生长状态良好的第三代骨髓间充质干细胞以10^8/ml接种于预先置有小盖玻片的6孔板中，将其放入37℃5%二氧化碳培养箱中进行培养。

（2）待细胞达到70%-80%融合后，加入分化诱导液。

（3）每3天换液一次，诱导14天后，对培养的细胞进行细胞分化水平的鉴定。

3 观察指标：

（1）细胞形态学观察。

（2）细胞多向分化能力的鉴定。

4 结 果

（1）在显微镜下观察发现，骨髓间充质干细胞呈圆形，大小不一，胞体透亮，折光率强。

（2）培养24 h后，可以观察到大量贴壁细胞，细胞形状呈短棒状。

（3）培养48 h后，细胞可呈扁平形，短梭形，小圆形或多角形，呈贴壁生长的状态。

（4）培养3、4天后，贴壁细胞数量增多。

（5）培养6、7天后，细胞大量增殖并出现融合现象，且发现胞体略大，细胞间排列紧密，大多数细胞呈梭形。

（6）将细胞传代培养至3、4代后，细胞体积较大，细胞呈梭形或纺锤形，此时细胞的核浆比例较小。

（7）在细胞诱导分化14天后，细胞出现类似神经元样细胞的改变，细胞形态各异，呈锥体形、球形、星形、梨形等。

（7）神经元细胞的表型特征将在第三代骨髓间充质细胞的培养中表现出来，这说明体外分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。

5 讨 论

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells ，BMSCs）是一种存在于骨髓基质内的，由中胚层细胞分化而来的具有多向分化潜能的干细胞。细胞处于未分化状态，增殖能力强，可在体外进行大量的培养，而且取材方便，自体移植不会发生免疫排斥反应，更与医学伦理问题无关。因此骨髓间充质干细胞的提取分化为治疗神经退行性疾病的提供的全新的探索空间。然而，骨髓间充质干细胞的含量在骨髓中所占比例极小，如果想要利用间充质干细胞进行研究和治疗，必须对其进行体外的分离培养及扩增。

骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，易于诱导为脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞，神经细胞及其他细胞。这种特性使其在中枢神经系相关统疾病的治疗中具有十分明显的优势。进行骨髓间充质干细胞的体外培养，诱导其定向分化为神经元样细胞，研究分化方法，可实现个体化治疗的目的，为临床使用提供了极大的便利，为骨髓间充质干细胞在神经系统损伤病变的修复过程起到的重要作用提供了理论基奠，并对研究修复神经系统损伤的研究进一步实验提供了可行性极大地实验研究方案；为治疗神经退行性疾病提供更多的治疗方案，为患者增加治愈的希望，尽可能减轻患者的经济负担，并对推进间充质干细胞研究的进程具有极其重要的意义。

骨髓间充质干细胞是用于治疗组织修复和重建的种子细胞，为骨髓间充质干细胞在神经系统损伤病变修复过程起到的作用提供理论基奠，并对研究修复神经系统损伤的进一步实验提供可行性实验研究方案，具有极大的发展空间。

[1] 戴文达,方涛林,李熙雷,林 红,董 健,等.人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定[J].复旦医学报(医学版),2008,35(3):448-452.

[2] 徐道华,周晨慧,刘钰瑜,许碧莲.等.大鼠骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞的定向诱导[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(1):125-128.

[3] 庄淑波,刘 毅,陈克明,肖 斌,等大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、纯化与培养适宜条件的筛选[J].中国组织工程研究,2007,11(20):3886-3891.

[4] 杨 丽,张荣华,谢厚杰,蔡 玉,黄 丰,等.建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定[J].中国组织工程研究,2009,13(6):1064-1068.

[5] 肖恒军,陈 俊,臧光辉,杨 骏,张 岩,闫卫新,高 新,等.大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化成平滑肌细胞,中国男科学杂志,2015,09,001:1008-0848.

[6] 孙江森,李 彪,龚跃昆,等骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的研究与进展[J] 中国组织工程研究,2012,16(6):1107-1134.

[7] 杨思远,石应康,周耀黄,赁 可.蒙炜等骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞，河南医学研究,2006,15,(4):299-301.

[8] 郭敏芳,李建远骨髓间充质干细胞体外定向诱导为心肌样细胞,实用全科医学,2007(1):3-4.