Nisin、山梨酸钾复合抑制尹家鸡翅中腐败菌的研究

孙梦桐，林洋，马欢欢，吕欣然，白凤翎，*，张平

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083；3.北镇市沟帮子食品有限公司，辽宁锦州121013）

Nisin、山梨酸钾复合抑制尹家鸡翅中腐败菌的研究

孙梦桐1，林洋1，马欢欢1，吕欣然2，白凤翎1，*，张平3

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083；3.北镇市沟帮子食品有限公司，辽宁锦州121013）

应用Nisin和山梨酸钾复合控制尹家鸡翅中的腐败菌。采用微生物学方法分离鸡翅中腐败菌，利用牛津杯打孔法对腐败菌进行抑制研究，应用复合制剂对产品进行保鲜作用研究。从腐败的尹家鸡翅中分离获得30株腐败菌，初步鉴定大多数为革兰氏阳性杆菌和球菌。Nisin在0.48 g/mL抑制28株腐败菌的生长，山梨酸钾在0.48 g/mL抑制27株腐败菌的生长，0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸钾对30株腐败菌均有抑菌作用。应用0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸钾在尹家鸡翅中保鲜作用较好，在第7天时，细菌菌落总数比对照组下降4个数量级且具有较好的感官评定，鸡翅中复合剂含量符合国家标准。尹家鸡翅中添加复合浓度0.24 g/mL的Nisin和山梨酸钾可使产品的货架期延长至7 d。

Nisin；山梨酸钾；复合；抑制；尹家鸡翅；腐败菌

熏鸡于清光绪十五年闻名并延续至今，深受广大消费者的青睐，其加工工艺堪称一流[1]。尹家鸡翅是其系列产品中一种低温气调包装产品。因原料和加工环节的污染，使产品中微生物本底值很高，气调保藏方式很难控制腐败菌的生长繁殖，导致产品腐败变质，因此保质期一般在2 d～3 d。采用强烈的热杀菌方式可有效控制产品中的腐败菌，但容易导致产品品质下降，一般采取添加防腐剂的方法控制产品中腐败菌的生长繁殖。Nisin是一种源于乳酸菌的安全、无毒、高效生物防腐剂，能够有效抑制明串珠菌、葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长繁殖，特别是对芽孢杆菌抑菌效果较好[2-3]。山梨酸钾可有效抑制食品中酵母、霉菌和需氧性细菌的生长繁殖，对革兰氏阴性菌的作用效果明显强于革兰氏阳性菌[4]，广泛使用于各种食品的防腐保鲜。Nisin和山梨酸钾复合应用具有提升抑菌强度和扩大抑菌谱的优势，徐世明等[5]应用0.035%Nisin、0.007%山梨酸钾和0.180%乳酸钠复配，成功使烧鸡货架期延长至20 d。康怀彬等[6]应用0.05%Nisin、0.05%溶菌酶、2.00%乳酸钠和1.00%双乙酸钠复配，使道口烧鸡产品在常温下贮藏期延长至20 d～25 d，经二次杀菌可使贮藏期达到60 d。王雪锋等[7]应用0.02% Nisin、0.20%山梨酸钾和4.00%乳酸钠复合保鲜剂，将真空包装熟叫花鸡贮藏期延长至21 d。将Nisin与山梨酸钾复合应用于鸡翅产品的防腐保鲜具有较好的协同作用，而添加乳酸钠和双乙酸钠会影响产品的风味，溶菌酶相对成本过高[8-11]。因此，本文应用传统微生物学方法从鸡翅产品中分离腐败菌，应用Nisin和山梨酸钾复合对腐败菌进行抑菌作用研究，并筛选最佳配比控制鸡翅产品中腐败菌生长，达到延长货架期的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验原料

尹家鸡翅：辽宁锦州北镇市沟帮子食品有限公司。

1.1.2 培养基和试剂

LB肉汤培养基、LB琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限公司；平板计数琼脂（PCA）、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂培养基（VRBGA）、乳酸细菌培养基（MRS）、琼脂培养基（STAA）、铜绿假单胞菌培养基（CN）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、麦康凯培养基（MAC)：青岛高科园海博生物技术有限公司；Nisin：浙江银象生物工程有限公司；山梨酸钾：河南锦德化工实业有限公司；重铬酸钾、硫代巴比妥酸、98%硫酸、36%盐酸、氢氧化钠、山梨酸钾（均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器

DL-CJ-2N型超级洁净工作台：东联哈尔（北京）仪器制造有限公司；MOTIC BA300数码显微镜：日本麦克奥迪（MOTIC）；GI54DS立式高压蒸汽灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振荡器：德国IKA公司；V3型全自动菌落计数仪：杭州迅数科技有限公司；超微量电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SPX-250智能生化培养箱：宁波海曙赛福实验仪器厂；SP-722E型可见分光光度计：北京东南仪诚实验室设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

在无菌条件下，取鸡翅10.0 g剪碎后放入90 mL灭菌生理盐水中，应用IKA Vortex GENIUS 3振荡器充分振荡5 min，静置20 min。

1.2.2 腐败菌的分离鉴定

用接种环挑取经过处理后的样液，PCA、VRBGA、MRS、STAA、CN、PDA和MAC上划线[12]，37℃培养48h，挑取平板上典型菌落进行划线分离纯化两次，挑取单菌落进行革兰氏染色后镜检。

1.2.3 抑菌试验

将纯化后的单菌落接种LB肉汤培养基，37℃培养24 h，用IKA Vortex GENIUS 3振荡器振荡2 min，混匀备用。参考文献[13]采用牛津杯打孔法，将10 mL素琼脂倒入无菌平板中，凝固后，将牛津杯放在素琼脂表面。吸取125 μL 106CFU/mL菌悬液置于25 mL 45℃～50℃LB琼脂培养基，摇匀，倒入置有牛津杯的平板中（不要倒进牛津杯的孔里）。待凝固后取出牛津杯，在牛津杯孔中分别加入125 μL的0.02、0.04、0.08、0.16、0.24、0.48 g/mL的Nisin和山梨酸钾及复合浓度为0.02、0.04、0.08、0.16、0.24 g/mL的Nisin和山梨酸钾，37℃培养48 h后，记录抑菌效果，选出应用抑菌浓度。

1.2.4 复合保鲜剂对尹家鸡翅保鲜研究

1.2.4.1 样品处理

选取抑菌试验筛选的Nisin、山梨酸钾和二者复合制剂，将样品在不同浓度试剂中浸泡4 min，取出装袋封口后4℃贮藏，分别在第1、3、5、7、9天时测细菌菌落总数，并以不添加试剂为对照。

1.2.4.2 细菌菌落总数的测定

按GB/T 4789.02-2012《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》的方法进行测定。

1.2.4.3 感官评价

感官质量评定指标包括气味、滋味、组织状态、外观及色泽，选取6名有经验的食品专业教师和学生采用Williams[14]9点评分法进行鸡翅的感官评分。9点评分分级为：9=极好，8=很好，7=好，6=次好，5=一般，4=一般以下，3=差，2=很差，1=极差，且评分≥5为可接受。

1.2.4.4 山梨酸钾含量测定

按照GB 1886.39-2015《食品安全国家标准食品添加剂山梨酸钾》对应用山梨酸钾试剂处理过的尹家鸡翅进行测定。

2 结果与讨论

2.1 腐败菌的分离与初步鉴定

尹家鸡翅中分离菌株革兰氏染色和菌落形态结果见表1。

表1列出了从各种选择性培养基中挑取的30个典型菌落，其中，PCA 4个、VRBGA 10个、STAA 8个、CN 2个、MRS 4个、PDA和MAC各1个。革兰氏阳性菌26个，占86.7%；革兰氏阴性菌4个，占13.3%。球状9个，占30.0%；杆状和短杆状21个，占70.0%。由此可见，导致尹家鸡翅腐败变质的优势菌群为革兰氏阳性杆菌，主要包括假单胞菌、热死环丝菌、乳酸菌和肠杆菌等，这与郭光平等[16]对非真空包装烧鸡中腐败菌的初始菌相构成的结果相似。

表1 尹家鸡翅中分离菌株革兰氏染色和菌落形态结果Table 1 Results of Gram staining and colony morphology of separate strains from Yinjia chicken wings

经革兰氏染色后的镜检结果如图1所示。

MRS分离的菌株为革兰氏阳性菌，呈现双排列；MAC分离的是革兰氏阴性杆菌，VRBGA分离的是革兰氏阳性短杆菌；STAA分离的为革兰氏阳性杆菌，形态大小各异。由此可以看出，导致尹家鸡翅腐败的主体细菌类群为革兰氏阳性杆菌。

2.2 抑菌试验结果

不同浓度Nisin和山梨酸钾以及两者复合制剂对30株分离菌的抑制作用结果见表2。

图1 尹家鸡翅中分离菌株的革兰氏染色结果（1 000×）Fig.1 Gram staining results of separate strains from Yinjia chicken wings

表2 Nisin和山梨酸钾对鸡翅中腐败菌的抑菌结果Table 2 Results of inhibition of spoilage bacteria using Nisin and potassium sorbate in chicken wings

从中可以看出，0.24 g/mL和0.48 g/mL的Nisin可分别抑制26株和28株分离菌的生长，不被抑制的菌株中PCA-1、VRBGA-7和VRBGA-8为革兰氏阴性菌，对Nisin不敏感。只有菌株PCA-4对Nisin具有较强的抗性。0.24 g/mL和0.48 g/mL的山梨酸钾分别可抑制26株和27株分离菌的生长，不被抑制的菌株中MRS-3、PCA-2、PCA-3为革兰氏阳性球菌，STAA-1为革兰氏阳性杆菌，可能是与山梨酸钾抑菌能力有关。0.16 g/mL Nisin和山梨酸钾和0.24 g/mL Nisin和山梨酸钾复合可抑制全部30株腐败菌的生长繁殖，说明Nisin和山梨酸钾两者的抑菌作用可以互补，具有协同作用效应。依据抑菌效果，将0.48 g/mL的Nisin和0.48 g/mL的山梨酸钾以及0.16、0.24 g/mL的Nisin和山梨酸钾复合应用到尹家鸡翅产品进行保鲜试验。

不同剂量的Nisin、山梨酸钾和两者复合制剂对尹家鸡翅中分离腐败菌的抑菌效果图如图2所示。

图2 不同试剂对鸡翅中腐败菌的抑菌结果Fig.2 Results of inhibition of spoilage bacteria from chicken wings using different preservative

从图2a中可以看出，0.08 g/mL山梨酸钾对菌株MRS-4生长具有一定的抑菌作用，随着浓度的增大，抑菌圈逐渐增大清晰；b中0.08 g/mLNisin对菌株MRS-4具有很好的抑菌作用，0.16 g/mL时抑菌效果已达到最好；图中c表明Nisin、山梨酸钾复合试剂对菌株MRS-4的抑制效果在0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸钾制剂、0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸钾制剂较好。

2.3 复合保鲜剂对尹家鸡翅保鲜效果中菌落总数测定结果

应用0.48 g/mL Nisin和0.48 g/mL山梨酸钾以及0.16 g/mL，0.24 g/mL Nisin和山梨酸钾复合对尹家鸡翅进行保鲜试验，贮藏9 d后细菌菌落计数指标结果如图3所示。

图3 应用Nisin和山梨酸钾制剂对尹家鸡翅中腐败菌的抑制结果Fig.3 Results of inhibition of spoilage bacteria using Nisin and potassium sorbate in Yinjia chicken wings

从图3中可以看出，不同试剂处理的产品与对照组相比较，添加0.48 g/mL Nisin的尹家鸡翅样品在第3天至第5天细菌菌落总数比未添加试剂对照组下降3至5个数量级，第7天至第9天时，细菌菌落总数下降2个数量级，9 d后细菌菌落总数逐渐增大；添加0.48 g/mL山梨酸钾的尹家鸡翅样品在第3、5、7天细菌菌落总数比未添加试剂对照组下降3、5、3个数量级，7 d后细菌菌落总数下降；添加0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸钾试剂的尹家鸡翅样品在第3、5、7天细菌菌落总数比未添加试剂的对照组分别下降3、5、1个数量级，7 d后细菌菌落总数下降；添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸钾的尹家鸡翅中的菌落总数在第3天至第5天比未添加试剂的对照组下降3个至5个数量级，在第7天细菌菌落总数比未添加试剂的对照组下降4个数量级。从整体来看，添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸钾的尹家鸡翅中的菌落总数从第1天至第7天始终比其他组的细菌菌落总数低，抑菌效果相对较好。

2.4 复合制剂对尹家鸡翅保鲜效果中感官评定结果

将添加0.48 g/mL Nisin和0.48 g/mL山梨酸钾以及0.16、0.24 g/mL Nisin和山梨酸钾复合制剂的样品分别在第1、3、5、7、9天进行感官评定，感官评定结果如图4所示。

图4 Nisin和山梨酸钾制剂处理尹家鸡翅的感官评分结果Fig.4 Results of sensory score of Yinjia chicken wings using Nisin and potassium sorbate

可以看出，随着贮藏时间增加，鸡翅感官质量下降，添加试剂的样品感官评价更好。从0至第7天，感官质量评分结果良好；7 d后感官质量迅速下降；到第9天对照组的感官评价不可接受（≤5分），添加试剂的样品感官评价较差。感官质量从高到低依次是0.24 g/ mL的Nisin和0.24 g/mL的山梨酸钾复合、0.48 g/mL山梨酸钾、0.48 g/mL Nisin以及0.16 g/mL的Nisin和0.16 g/mL的山梨酸钾复合。因此，说明添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸钾复合在保持原有口感的条件下可将尹家鸡翅的贮藏期从2 d延长至7 d，这与抑菌试验、菌落总数测定结果相一致。

2.5 尹家鸡翅中山梨酸钾测定结果

应用国标方法测得尹家鸡翅样品中山梨酸钾含量见表3，可以看出所有添加山梨酸钾的样品中山梨酸钾残留量不超过国家标准限量要求（0.075 g/kg）。

表3 尹家鸡翅中山梨酸钾测定结果Table 3 Results of the determination of potassium sorbate in Yinjia chicken wings

3 结论

尹家鸡翅产品是一种低温气调包装的即食禽类制品，由于原料和加工等原因导致产品本身腐败菌污染严重，采用气调方式很难控制其腐败菌的生长。本文应用PCA、VRBGA、MRS、STAA、CN和MAC固体培养基经分离纯化筛选出30株腐败菌菌株，进而应用Nisin和山梨酸钾及二者复合试剂对30株腐败菌进行抑菌试验，确定0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸钾复合制剂对尹家鸡翅进行保鲜试验，结果显示可使鸡翅产品货架期从2 d延长至7 d，且添加山梨酸钾的鸡翅中山梨酸钾含量均符合国家标准。本研究为Nisin和山梨酸钾应用于速食禽制品的防腐保鲜提供借鉴与参考。

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Properties of Inhibition of Spoilage Bacteria Using Nisin and Potassium Sorbate Combinations in Yinjia Chicken Wings

SUN Meng-tong1，LIN Yang1，MA Huan-huan1，LÜ Xin-ran2，BAI Feng-ling1，*，ZHANG Ping3
（1.College of Food Science and Technology，Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；3.Beizhen Gou-Bangzi Food Co.，Ltd.，Jinzhou 121013，Liaoning，China）

Application of Nisin with potassium sorbate complex agent control spoilage bacteria in Yinjia chicken wings.Spoilage bacteria were isolated from the chicken wings using the microbiological method，and the inhibition effect of Nisin with potassium sorbate complex agent on the spoilage bacteria was studied by the oxford cup method.Study on preservation of the product by using the complex agent.Thirty spoilage bacteria strains were isolated from Yinjia chicken wings，and preliminary identification of the majority of Gram-positive bacilli and cocci.Inhibition of the growth of 28 spoilage bacteria by 0.48 g/mL Nisin；Inhibition of the growth of 27 spoilage bacteria by 0.48 g/mL potassium sorbate；0.16 g/mL Nisin with potassium sorbate complex agent had bacteriostatic effect on 30 representative spoilage bacteria.The preservation effect of 0.24 g/mL Nisin with potassium sorbate complex agent on Yinjia chicken wings is better than that other concentration complex agent.The total bacteria count decreased 4 log units and maintained good sensory quality in treatment group than the control during 7 day storage，as well as the content of preservation meet the national standard in Yinjia chicken wings.Addition of 0.24 g/mL of Nisin and 0.24 g/mL of potassium sorbate combination in Yinjia chicken wings can make the shelf life be extended to 7 d.

Nisin；potassium sorbate；complex；inhibition；Yinjia chicken wings；spoilage bacteria

2016-12-11

孙梦桐（1992—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品安全与质量控制。

*通信作者：白凤翎（1964—）男，教授，博士，研究方向：食品安全与质量控制和食品微生物学。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.039