竹荪菌丝中邻苯二甲酸二丁酯含量的测定与分析

丁邦菊，汤洪敏，2，*

（1.贵州民族大学民族医药学院，贵州贵阳550025；2.贵州民族大学贵州民族医药研究院，贵州贵阳550025）

竹荪菌丝中邻苯二甲酸二丁酯含量的测定与分析

丁邦菊1，汤洪敏1，2，*

（1.贵州民族大学民族医药学院，贵州贵阳550025；2.贵州民族大学贵州民族医药研究院，贵州贵阳550025）

测定不同生长时间竹荪菌丝中邻苯二甲酸二丁酯（DBP，Dibutyl Phthalate）的含量，探讨竹荪菌丝对DBP是否存在富集作用。通过外标法，并做加标回收试验，以培养液及空白培养液作为对照，用乙酸乙酯为溶剂，超声波辅助提取溶剂法提取竹荪菌丝干品中的DBP，并应用气相色谱-质谱联用仪对其进行分析测定。结果表明：（1）DBP标准线性回归方程为y=26 021x-74 798，R2=0.999 9，证明方法在5.0 μg/mL～100.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系。实际样品加标回收率为95.4%～105.0%，平均回收率为98.9%，RSD为3.4%。（2）在空白培养液中检测出一定含量的DBP，其浓度为19.30 μg/mL。不同培养时间的培养液中DBP的浓度在17.71μg/mL～20.50 μg/mL范围，相应培养时间的竹荪菌丝中DBP的含量在28.86 mg/kg～33.52 mg/kg范围。竹荪菌丝在培养过程中，能产生和释放一定量的DBP，并也能一定程度地富集环境中的DBP。

竹荪；菌丝；气相色谱-质谱联用；邻苯二甲酸二丁酯（DBP）

竹荪（Dictyophora indusiata），是食用真菌[1]。其营养丰富，具备药食同源的价值。主要分布于云南、四川、贵州、湖南省市。经研究发现，竹荪具有调脂降压、抑制肿瘤细胞生长的作用、抗氧化、增强免疫、保肝[2]等功效。目前，对竹荪的研究主要集中在栽培技术与加工[3-4]，竹荪营养含量分析[5]，活性成分与药效，提取工艺及其分离纯化鉴定等[6-7]方面。其中，对竹荪化学成分的研究中，已有文献报道竹荪中含有邻苯二甲酸酯类物质[8-10]。邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是邻苯二甲酸酯类（PAEs，Phthalate Esters）的一类重要化合物，工业上被广泛用于塑料制品的生产，还用作农药、杀虫剂、化妆品、香料等生产材料。DBP在各类环境中广泛存在，为优先控制污染物。对人群健康的危害主要表现在三方面，即急性毒性；致畸、致癌、致突变作用；生殖发育毒性[11]。但有报道在真菌中存在天然的DBP[12]，对蚊虫具有一定的驱避作用[13]，并且生物对PAEs类具有一定的富集与降解作用[14-15]。

目前，对DBP的研究主要集中于水、土壤、食品以及对人体的毒性作用，而对药用植物、真菌中的DBP研究较少。关于对竹荪菌丝中DBP的富集作用研究未见报道，因此，本课题研究旨在通过有机溶剂对不同生长时间竹荪菌丝进行提取，采用GC-MS分析测定，外标法定量。并做相应空白对照，确定不同生长时间竹荪菌丝、培养液及空白培养液中DBP的含量。并对三者中DBP含量进行分析比较，判断竹荪菌丝对DBP是否具有富集作用，对竹荪产品的质量保证和拓展开发潜能具有重要现实意义，为进一步带动竹荪种质的多方向开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

竹荪菌丝：贵州省榕江县野生竹荪转接保存菌丝；培养基：综合马铃薯液体培养基。

邻苯二甲酸二丁酯标准品：分析纯，天津市富精细化工有限公司；乙酸乙酯（色谱纯）、葡萄糖（分析纯）：天津市优谱化学试剂有限公司；甲醇、丙酮、硫酸镁：分析纯，重庆川江化学试剂厂；磷酸二氢钾：分析纯，重庆茂业化学试剂有限公司；维生素B1：生化试剂，天津市光复精细化工研究所。

1.2 主要仪器

Agilent7890/5975C-GC/MSD气相色谱—质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

依据王鑫等[16]对食品中邻苯二甲酸酯类污染物的分析研究中的文献方法，略加改进。准确移取邻苯二甲酸二丁酯标品1.00 mL，用乙酸乙酯逐步稀释制备成105 μg/mL的标准储备液，于4℃冰箱保存备用。根据所需浓度再逐级用乙酸乙酯进行稀释。以DBP系列标准液浓度（x）为横坐标，平均响应值（y）为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。

1.3.2 样品的制备

1.3.2.1 竹荪菌丝的培养与干品制备

通过打孔法将菌丝定量接种于250 mL三角瓶50 mL综合马铃薯液体培养基中，25℃、110 r/min恒温摇床上分别培养15、30、45 d，同时并作空白培养液对照。按培养时间依次取出，并抽滤菌丝，滤液（即培养液，取100 mL）用无菌棕色广口瓶储存，于4℃冰箱中贮存备用。竹荪菌丝经蒸馏水重复洗3遍，抽滤，于30℃的干燥箱中烘干至恒重，研磨，分别获15、30、45 d培养的竹荪菌丝干品0.97、1.13、1.04 g。

1.3.2.2 竹荪菌丝干品DBP的提取

分别准确称取15、30、45d竹荪菌丝干品粉末0.5g（精确到0.000 1 g）至20 mL具塞磨口玻璃试管，加入5.0 mL乙酸乙酯，振荡混匀，浸置30 min，在60℃的超声条件下提取40 min，收集提取液，再加入5.0 mL乙酸乙酯重复提取2次，每次20 min，合并提取液，室温下氮气吹干，乙酸乙酯定容至1.0 mL，待GC-MS进行分析测定，外标法定量，然后进行样品含量计算。

1.3.2.3 空白培养液、培养液中DBP的提取

取0、15、30、45 d空白培养液与培养液，分别于80℃条件下旋转蒸发浓缩至近干，移至50 mL具塞磨口锥形瓶中，按竹荪菌丝干品相同步骤处理（提取过程中用到分液漏斗，将乙酸乙酯提取液与培养液分离），其测定分析方法同上。

1.3.3 气相色谱条件

色谱柱：Agilent 19091S-433HP－5MS（325℃：30 m× 0.25 μm×0.25 μm）；进样口温度230℃；升温程序：初始柱温190℃，保持2 min，以10℃/min升温至250℃，保持5 min，后运行5 min，升至260℃，共运行13 min；载气（He，纯度≥99.999%），流速1 mL/min；进样量：1.0 μL；分流比10∶1。

1.3.4 质谱条件

电子离源；电子能量70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，乙酸乙酯提取物溶剂延迟2.50 min，质量扫描范围m/z 50～500。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以DBP标准溶液浓度x为横坐标，平均响应值y为纵坐标绘制标准曲线（见图1），DBP标准线性回归方程为y=26 021x-74 798，R2=0.999 9，证明DBP标准溶液浓度在5.0 μg/mL～100.0 μg/mL范围内有良好的线性关系。

图1 DBP标准曲线Fig.1 Standard curve of DBP

2.2 测定结果

经GC-MS对空白培养液中的DBP进行了5次平行分析测定。空白培养液中的DBP浓度为19.30μg/mL。

对不同时间的培养液以及竹荪菌丝中的DBP分别进行5次平行分析测定。测定试验用外标法进行定量，其测定结果见表1与表2。

表1 培养液中DBP的检测结果Table 1 The results of DBP from culture medium

表2 不同生长时间竹荪菌丝提取液中DBP的检测结果Table 2 Analytical results of DBP from extracts of Dictyophora myceliums in different time

不同培养时间培养液的DBP的浓度在17.71μg/mL～20.50 μg/mL范围内，其中30 d含量最高。培养液中DBP含量的波动变化受菌丝的生长影响。而在不同培养时间菌丝中的DBP的含量在28.86 mg/kg～33.52 mg/kg范围，其中生长30 d的菌丝中的DBP含量最低。

2.3 样品加标回收率与精密度试验

以30 d竹荪菌丝干粉样品减半量进行添加回收试验。按100%的供试品溶液浓度添加DBP标准溶液，其中添加浓度为10.87 μg/mL。按照试验相同条件及其步骤，平行测定9次，外标法定量。计算回收率及其精密度（RSD），其测定结果如表3所示。样品加标回收率为95.4%～105.0%，其平均回收率为98.9%，RSD为3.4%。结果表明，该方法能够满足样品的测定要求。

表3 竹荪菌丝样品中DBP添加回收试验结果及RSD（n=9）Table 3 Recoveries and RSDs of DBP spiked into Dictyophora mycelium（n=9）

3 结论与讨论

DBP属于PAEs中的一类重要化工原料，广泛用于农药、杀虫剂、化妆品、香料等的生产中。因此，试验过程中应尽量避免PAEs类化合物的污染。为了试验结果的准确度，试验前按试验提供的GC-MS分析条件，进行了试剂空白试验，后续试验中所测得的试验均为扣除空白值。试验结果表明：空白培养液、不同培养时间的培养液以及竹荪菌丝提取液中均含有DBP。

3.1 空白培养液中DBP含量及来源分析

在空白培养液提取液中被检测到较高的DBP含量，浓度达19.30 μg/mL。可能是培养基原料中的带入，以及试验过程中培养基透气封口膜和一次性过滤器的使用之故。

3.2 培养液中DBP的含量及变化分析

由于空白培养液本身存在一定的DBP物质，所以培养液中也含有一定的DBP含量，浓度在17.71～20.50 μg/mL范围，且与空白培养基的DBP浓度相比呈现降升降的趋势，说明在菌丝培养过程中，培养液中DBP含量受菌丝生长的影响。

3.3 竹荪菌丝中DBP的含量及变化分析

竹荪菌丝中含有较高的DBP含量，含量在28.86mg/ kg～33.52 mg/kg范围，含量呈现升降升的趋势。表现为竹荪菌丝生长初期对环境中（培养基）的DBP具有一定的富集作用。随着竹荪菌丝生长的进行，本身也能够产生一定量的DBP，并通过释放到环境中（培养基）中，致使培养基的DBP含量升高，可能为实现环境的趋避作用。菌丝生长后期，通过自生产生和对培养基中DBP的富集，致使菌丝中DBP的浓度反弹升高，导致菌丝中的DBP浓度远大于培养液中的DBP浓度。可能是生长后期为实现趋避作用加强自生保护所致。

综上所述，竹荪菌丝在培养过程中，能产生一定量的DBP，并能可释放一定浓度到环境中，也能一定程度地富集环境中的DBP，环境中和菌丝体内DBP类代谢物的增加，能提高菌丝本身对蚊虫等的驱避作用。竹荪菌丝产生和富集DBP的生物学功能，可作为制备绿色环保的生物驱避剂原料来源，拓展人们对竹荪资源的开发利用范围。

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Determination and Analysis of Dibutyl Phthalate in Mycelium of Dictyophora

DING Bang-ju1，TANG Hong-min1，2，*
（1.College of National Medicine，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Guizhou Institute of Ethnic Medicine，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

To study the effects of Dictyophora mycelium on the accumulation of dibutyl phthalate（DBP），and determine the content of DBP from it in different growth stages.Through the external standard method and standard addition recovery experiment，the medium and blank medium as control groups，the DBP was separated from dried Dictyophora mycelium by ultrasonic-assisted solvent extraction method with ethyl acetate，and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.The results showed that：（1）The regressione equation of calibration curve was y=26 021x-74 798，the correlative coefficient was 0.9999，and proof method had good linearity within 5.0 μg/mL-100.0 μg/mL range.The actual recoveries were 95.4%-105.0%，the average recovery was 98.9%，and relative standard deviation was 3.4%.（2）A certain amount of DBP was detected from the extracts of blank medium，and its concentration was 19.30 μg/mL.The concentration of DBP from medium in different time was in the range of 17.71 μg/mL-20.50 μg/mL，and the concentration of DBP in the Dictyophora mycelium was 28.86 mg/kg-33.52 mg/kg during the corresponding culture time.Dictyophora mycelium can produce and release a certain amount of DBP during the culture process，and also enrich the DBP in the environment.

Dictyophora；mycelium；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；DBP

2016-11-20

国家自然基金项目地方基金项目（31160013）；贵州民族大学科研基金资助项目（201415）

丁邦菊（1992—），女（侗），在读硕士，研究方向：民族传统医药。

*通信作者：汤洪敏（1969—），女（汉），教授，博士，研究方向：种质资源保护。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.028