10种维吾尔药微生物限度检查方法及探讨

古丽巴哈尔·托乎提，李海芳，顾金花，杨玲玲，张明君，李小燕，哈丽旦·苏来曼

(新疆维吾尔自治区食品药品检验所药理与微生物检验室，新疆 乌鲁木齐 830002)



10种维吾尔药微生物限度检查方法及探讨

古丽巴哈尔·托乎提*，李海芳，顾金花，杨玲玲，张明君，李小燕，哈丽旦·苏来曼

(新疆维吾尔自治区食品药品检验所药理与微生物检验室，新疆 乌鲁木齐 830002)

目的：建立10种维吾尔药的微生物限度检查方法。方法：对10种维吾尔药进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验及控制菌检查方法的适用性试验。结果：需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验中，按平皿法，供试液制备为1∶10时，依提尔菲力艾皮提蒙蜜膏、复方沙拉吉提丸、开胃加瓦日西阿米勒蜜膏、依提尔菲力吾斯提库都斯蜜膏、复方苏拉甫蜜膏、穆派日克力甫蜜膏的回收比在0.5～2范围内，无明显抑菌现象；而再尔吾尼蜜膏、罗补甫艾斯热蜜膏对枯草芽孢杆菌，加瓦日西安比尔蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有不同程度的抑菌作用，但可通过制成1∶100的供试液按平皿法消除抑菌作用。采用直接接种法进行10种维吾尔药的控制菌检查，菌株正常生长，10种维吾尔药对上述细菌无抑制作用。结论：依提尔菲力艾皮提蒙蜜膏、复方沙拉吉提丸、开胃加瓦日西阿米勒蜜膏、依提尔菲力吾斯提库都斯蜜膏、复方苏拉甫蜜膏、穆派日克力甫蜜膏可通过制备为1∶10的供试液、采用平皿法检验需氧菌；再尔吾尼蜜膏、罗补甫艾斯热蜜膏、加瓦日西安比尔蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏可通过制备为1∶100的供试液、采用平皿法检验需氧菌；10种维吾尔药均可通过制备为1∶10的供试液、采用平皿法检验霉菌和酵母菌；10种维吾尔药均可采用直接接种法检查控制菌。

维吾尔药； 微生物限度； 方法适用性； 回收比

口服制剂的微生物污染状况是其质量控制的重要指标[1-3]。微生物限度是口服制剂的必检项目，维吾尔药制剂为含有多种维吾尔药材及中药材成分的复方制剂[4]，可能存在一定抑菌活性。故在对具有抗菌活性的药品进行微生物限度检查时，应首先消除其抗菌活性，以保证检验结果的真实性、有效性[5-6]。由于原料来源、生产工艺、辅料等的不同，导致同一产品但不同厂家、甚至同一厂家但不同批次的药品对同一种微生物的抑制程度不同[7]。参考《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)，建立10种维吾尔药的微生物限度检查方法，为检验机构提供参考，并进一步提高产品质量，防止微生物污染。

1 材料

1.1 仪器

DHP120型细菌培养箱(上海市实验仪器总厂)；QS-PY150型智能型生化培养箱(上海奇珊电子科技有限公司)；SL601 N型电子天平(上海民桥精密科学仪器公司)；ZDX-35BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海富骏机械制造有限公司)；MS3圆周振荡器(德国艾卡集团)。

1.2 药品

加瓦日西安比尔蜜膏(批号：20150802、20141103、20150401)；再尔吾尼蜜膏(批号：20151103、20150802、20150401)；依提尔菲力艾皮提蒙蜜膏(批号：20151203、20150802、20150401)；罗补甫艾斯热蜜膏(批号：20151203、20150702、20150301)；复方沙拉吉提丸(批号：20151103、20150602、20150301)；开胃加瓦日西阿米勒蜜膏(批号：20150301、20150702、20151203)；依提尔菲力吾斯提库都斯蜜膏(批号：20150501、20150902、20151203)；加瓦日西卡尼沙蜜膏(批号：20151203、20150401、20150301)复方苏拉甫蜜膏(批号：20151203、20150602、20150401)；穆派日克力甫蜜膏(批号：20151101、20151102、20151203)；以上药品均由新疆和田民丰县维吾尔医医院生产。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂(批号：20151030)；沙氏葡萄糖琼脂(批号：20151030)；胰酪大豆胨液体(批号：20151029)；肠道菌增菌液体(批号：20150902)；紫红胆盐葡萄糖琼脂(批号：20150831)；沙氏葡萄糖液体(批号：2015092)；麦康凯液体(批号：20151026)；麦康凯琼脂(批号：20150823)；RV沙门菌增菌液体(批号：20150902)；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(批号：20130702)；pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：20150813)；以上培养基均由中国药品生物制品检定研究院提供。

1.4 菌种

枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、大肠埃希菌、沙门菌均由中国食品药品检定研究院菌种保藏中心提供。

2 方法

2.1 菌液的制备

2.1.1 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌悬液：取经33 ℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌胰酪大豆胨液体培养物，加入pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数≤10 000 cfu/ml的菌悬液，即得。

2.1.2 大肠埃希菌、沙门菌菌悬液：取经33 ℃培养18～24 h的大肠埃希菌、沙门菌胰酪大豆胨液体培养物，加入pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数≤100 cfu/ml的菌悬液，即得。

2.1.3 白色念珠菌菌悬液：取经25 ℃培养2～3 d的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物，加入pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数≤10 000 cfu/ml的菌悬液，即得。

2.1.4 黑曲霉孢子悬液：取经25 ℃培养5～7 d的黑曲霉斜面培养物，加入含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液3～5 ml洗下孢子，吸出孢子悬液，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数≤10 000 cfu/ml的孢子悬液[1-2]。

2.2 需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验

2.2.1 供试液的制备：取样品10 g，加入pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1∶10的供试液，或加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液进一步稀释成1∶100的供试液[2]。

2.2.2 菌液组菌落数计算：取“2.1.1”“2.1.3”“2.1.4”项下菌液各0.1 ml(菌落数为3 000～10 000 cfu/ml)，加入pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml中，取混合液1 ml注入平皿，加入胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，测定菌液中的菌落数，结果记为a。

2.2.3 对照组菌落数计算：取“2.2.1”项下供试液1 ml，注入平皿，加入胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，测定样品中的菌落数，结果记为b。

2.2.4 验证组菌落数计算：取“2.1.1”“2.1.3”“2.1.4”项下菌液各0.1 ml(菌落数为3 000～10 000 cfu/ml)，加至“2.2.1”项下供试液10 ml中，取混合液1 ml注入平皿，加入胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，测定菌液中的菌落数，结果记为c。

2.2.5 回收比的计算：“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”项下胰酪大豆胨琼脂培养基平板在33 ℃培养3～5 d，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在23 ℃培养5～7 d后计数。回收比R=(c-b)/a。根据《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)，当0.5≤R≤2，则可认为该计数方法可用于样品的菌落计数。

2.3 大肠埃希菌检查方法适用性试验

2.3.1 供试液的制备：取样品10 g，加入pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1∶10的供试液，或加pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液进一步稀释成1∶100的供试液[2]。

2.3.2 培养物的制备：取“2.3.1”项下供试液10 ml，接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，即为供试品组。取pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10 ml，接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，即为阴性对照组。取“2.3.1”项下供试液10 ml，接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入“2.1.2”项下大肠埃希菌菌悬液(菌落数10～100 cfu)，即为阳性验证组。

2.3.3 适用性试验：将“2.3.2”项下培养物于33 ℃培养24 h，再分别取培养物1 ml，接种至100 ml麦康凯液体培养基中，于42 ℃培养48 h。将培养物划线于麦康凯琼脂平板上，于33 ℃培养24 h。若阳性验证组检出大肠埃希菌，可认为该方法适用于样品的大肠埃希菌检查。

2.4 耐胆盐革兰阴性菌检查方法适用性试验

2.4.1 供试液的制备：取样品10 g，加胰酪大豆胨肉汤培养基至100 ml，匀浆，制成1∶10的供试液。

2.4.2 培养物的制备：取“2.4.1”项下供试液10 ml，即得供试品组。取胰酪大豆胨肉汤培养基10 ml，即为阴性对照组。取2份“2.4.1”项下供试液10 ml，分别加入“2.1.1”、“2.1.2”项下大肠埃希菌菌悬液和铜绿假单胞菌菌悬液(菌落数10～100 cfu)，即为阳性验证组。

2.4.3 适用性试验：将“2.4.2”项下培养物于23 ℃培养2 h，再分别取培养物10 ml接种至100 ml肠道菌增菌液体培养基中，于33 ℃培养24 h。将培养物划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，于33 ℃培养24 h。若阳性验证组检出大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，可认为该方法适用于样品的耐胆盐革兰阴性菌检查。

2.5 沙门菌检查方法适用性试验

2.5.1 供试液的制备：取样品10 g，加胰酪大豆胨肉汤培养基至200 ml，即得。

2.5.2 培养物的制备：取“2.5.1”项下供试液200 ml，即为供试品组。取胰酪大豆胨肉汤培养基200 ml，即为阴性对照组。取“2.5.1”项下供试液200 ml，加入“2.1.2”项下沙门菌菌悬液(菌落数10～100 cfu)，即为阳性验证组。

2.5.3 适用性试验：将“2.5.2”项下培养物于33 ℃培养24 h。分别取培养物0.1 ml接种至10 ml RV沙门增菌液体培养基中，于33 ℃培养24 h。取少量RV沙门菌增菌液体培养物，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于33 ℃培养24 h。若验证组检出沙门菌，可认为该方法适用于样品的沙门菌检查。

3 结果

3.1 供试液浓度为1∶10时需氧菌、霉菌和酵母菌的回收比

供试液为1∶10时，对于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，依提尔菲力艾皮提蒙蜜膏、复方沙拉吉提丸、开胃加瓦日西阿米勒蜜膏、依提尔菲力吾斯提库都斯蜜膏、复方苏拉甫蜜膏、穆派日克力甫蜜膏的回收比在0.5～2范围内，无明显抑菌现象；而再尔吾尼蜜膏、罗补甫艾斯热蜜膏对枯草芽孢杆菌，加瓦日西安比尔蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有不同程度的抑菌作用，见表1。

表1 10种维吾尔药对需氧菌、霉菌和酵母菌的回收比(供试液浓度为1∶10)

注：*表示所得数据为胰酪大豆胨琼脂和沙氏葡萄糖琼脂培养基上的回收比

Note：*indicates the obtained data are recovery ratio of TSA and SDA on culture medium

3.2 供试液浓度为1∶100时需氧菌的回收比

供试液浓度为1∶100时，对于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，再尔吾尼蜜膏、罗补甫艾斯热蜜膏、加瓦日西安比尔蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏的回收比均>0.5，可用于4种维吾尔药的需氧菌总数检测，见表2。

表2 4种维吾尔药对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收比(供试液浓度为1∶100)Tab 2 Recovery ratio of ten kinds of Uighur drugs to staphylococcus aureus and bacillus subtilis (1∶100 sample)

注：“—”表示1∶10供试液已通过回收率试验

Note：“—” indicates the 1∶10 sample passing the recovery test

3.3 10种维吾尔药对控制菌的检验结果

10种维吾尔药对控制菌无抑制作用，见表3。

4 讨论

自《中华人民共和国药典》(2005年版)[8]出现，微生物限度检查开始引入方法验证试验。而由于《中华人民共和国药典》(2015年版)培养体系的变化，微生物限度检查方法将需要再次验证。与2010年版相比，《中华人民共和国药典》(2015年版)增加了供试品制备中的稀释液种类，采用胰酪大豆胨液体培养基和胰酪大豆胨琼脂培养基取代了营养肉汤和营养琼脂培养基，用于需氧菌总数检查，采用沙氏葡萄糖琼脂培养基取代了玫瑰红钠培养基检测霉菌与酵母菌总数；将原来的细菌总数检查更名为需氧菌总数检查，这其中就包括了细菌、霉菌、真菌等可在此培养基上生长的所有需氧微生物；2010年版所使用的培养基对目标菌的选择性强，不能满足所有微生物的生长需要[9]，而2015年版所使用的培养基具有良好的广谱性，对目标微生物生长选择性低，有利于微生物的修复与生长，提高检出率，且在控制菌检查上增加了耐胆盐革兰阴性菌检查，简化了大肠埃希菌的检验方法，变更了乙型副伤寒沙门菌的培养基种类，取消了大肠菌群的检查。

表3 10种维吾尔药对控制菌的检验结果Tab 3 Result of ten kinds of Uighur drugs to control bacteria

注：“+”表示菌株正常生长

Note：“+” indicates strains with normal growth

制剂质量标准检查项目中的微生物限度检查是保障药品使用安全的重要指标之一[10-11]。适用性试验确认了供试品在所采用的检查方法和检验条件下有无抑菌作用，以保证供试品所污染的微生物能被充分检出。维吾尔药通常成分复杂，含有维吾尔药和中药成分。其中，中药药源广泛，成分多样，可直接抗菌[12-13]，有些成分会抑制需氧菌，有些成分会抑制真菌，故中药材真菌及真菌毒素污染现象普遍[14]，任何具有抑菌作用的成分均可影响微生物限度检查的准确性。中药制剂微生物污染的限度是中药制剂临床应用是否安全有效的一项重要参数，中药制剂微生物限度必须符合《中华人民共和国药典》(2015年版)的要求[1-2，15]。与中药制剂相同，维吾尔药也必须针对其微生物污染的因素，采取积极的对策进行预防。本研究以《中华人民共和国药典》(2015年版)微生物限度检查方法适用性作为依据，确定了上述10种维吾尔药微生物限度检查的方法。

上述10种维吾尔药制剂微生物限度标准为：需氧菌总数104cfu/g；霉菌和酵母菌总数102cfu/g；不得检出大肠埃希菌(1 g)；不得检出沙门菌(10 g)；耐胆盐革兰阴性菌应<102cfu/g。本研究结果表明，需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验中，可按平皿法、且供试液为1∶10检验的是依提尔菲力艾皮提蒙蜜膏、复方沙拉吉提丸、开胃加瓦日西阿米勒蜜膏、依提尔菲力吾斯提库都斯蜜膏、复方苏拉甫蜜膏、穆派日克力甫蜜膏；而需氧菌总数可按平皿法、且供试液为1∶100检验的是再尔吾尼蜜膏、罗补甫艾斯热蜜膏、加瓦日西安比尔蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏。10种维吾尔药的控制菌控制菌检查可根据直接接种法进行。

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Investigation of Microorganism Limited Inspecting Method on Ten Kinds of Uighur Drugs

Gulibaha’er·TUOHUTI, LI Haifang, GU Jinhua, YANG Lingling, ZHANG Mingjun, LI Xiaoyan, Halitan·SULAIMAN

(Laboratory of Pharmacology and Microbiology, Xinjiang Uygur Autonomous Region for Food and Drug Inspection Institute, Xinjiang Urumqi 830002,China)

OBJECTIVE: To establish the microorganism limited inspecting method on ten kinds of Uighur drugs. METHODS: Adaptability tests of aerobic bacteria, mold and yeast count methods and control bacteria examination methods were conducted on ten kinds of Uighur drugs. RESULTS: According to adaptability test of aerobic bacteria, mold and yeast count methods, there was no significant bacteriostatic phenomenon for Yiti’erfeili’ aipitimengmigao, Compound shalajitiwan, Kaiweijiawarixi’amilemigao, Yiti’erfeiliwusitikudusimigao, Compound sulafumigao and Mupair-ikelifumigao within recovery ratio of 0.5-2 when the examine probational liquid of 1∶10. However, the Zai’erwunimigao, Luobufu’aisiremigao have different inhibitory effects on bacillus subtilis, while Jiawarixi’anbi’ermigao, Jiawarixikanishamigao have different inhibitory effects on bacillus subtilis staphylococcus aureus,which could be eliminated by the examine probational liquid of 1∶100. Direct inoculation method was adopted to examine control bacteria of ten kinds of Uighur drugs, strains were in normal growth, and ten kinds of Uighur drugs had no inhibition. CONCLUSIONS: Yiti’erfeili’aipitimengmigao, Compound shalajitiwan, Kaiweijiawarixi’amilemigao, Yiti’erfeiliwu-sitikudusimigao, Compound sulafumigao and Mupairikeli-fumigao can detect aerobic bacteria through preparation of the examine probational liquid of 1∶10 and plate method. And Zai’erwunimigao, Luobufu’aisiremigao, Jiawarixi’anbi’ermigao, Jiawarixikanishamigao can detect aerobic bacteria through preparation of the examine probational liquid of 1∶100 and plate method. Ten kinds of Uighur drugs can detect molds and yeast through preparation of the examine probational liquid of 1∶10 and plate method; ten kinds of Uighur drugs can detect the control bacteria by direct inoculation method.

Uyghur drugs; Microbial limit; Method validation; Recovery ratio

R927.1

A

1672-2124(2017)07-0940-04

2017-03-07)

*高级实验师。研究方向：微生物检验。E-mail：gulbahartohti@sina.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.07.028