结核性脑膜炎患者脑脊液中细胞因子水平的诊断价值

刘永莉，李明武，赖明红，万荣

结核性脑膜炎患者脑脊液中细胞因子水平的诊断价值

刘永莉，李明武，赖明红，万荣

目的：探讨分泌性靶抗原-6（ESAT-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-10（IL-10）和干扰素-γ（IFN-γ）对于早期诊断结核性脑膜炎（TBM）的临床应用价值。方法：选取48例TBM患者为研究组，29例非结核性中枢神经系统感染患者为对照组，35例普通头痛患者为正常组。采用ELISA法分别检测所有患者脑脊液中的ESAT-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平。结果：研究组的ESAT-6、TNF-α、IFN-γ水平与对照组相比增高，研究组与对照组的ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平均高于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。研究组的ESAT-6与IFN-γ水平呈正相关（r=0.96，P＜0.05）。4项指标联合检测的灵敏度明显高于使用ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ单一指标，差异均具有统计学意义（χ2=10.936，18.104，12.647，13.978；P＜0.05）。结论：ESAT-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10在TBM患者脑脊液中的表达水平显著升高，对早期诊断TBM具有重要的临床价值，而且4项联合检测较单一检测的诊断效果更佳。

结核性脑膜炎；分泌性靶抗原-6；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-10；干扰素-γ

结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是由于结核杆菌侵入淋巴系统或随血液散播入脑引发的脑膜非化脓性炎症性疾病[1]，其早期的临床症状不明显，病情发展迅速。诊断常用的脑脊液结核杆菌培养耗时长，阳性检出率较低，导致早期诊断较困难。因此，找到一种简便、特异、敏感的诊断方法对于TBM具有重要的临床意义。本研究探讨早期分泌性靶抗原-6（early secreting antigenic target-6，ESAT-6）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平对早期诊断TBM的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3月至2015年6月于昆明市第三人民医院就诊的疑似TBM患者112例，就诊后均进行脑脊液结核杆菌培养及染色检查，确诊为TBM患者48例为研究组，均符合TBM确诊标准[2]：脑脊液结核杆菌培养或染色阳性；临床表现为头痛、发热、呕吐、脑膜刺激征、颅内压增高等。另符合下列标准一条以上：头颅CT检查发现脑积水、脑梗死、脑膜强化等表现；存在肺结核；抗结核治疗有效。确诊为非结核性中枢神经系统感染患者29例为对照组，其中隐球菌性脑膜炎8例、化脓性脑膜炎6例，病毒性脑膜炎15例。另以头痛症状为主，但神经系统体征、脑脊液及相关辅助检查均正常的患者35例为正常组，男19例，女16例；年龄（38.5±8.7）岁；对照组，男16例，女13例；年龄（39.6±9.8）岁；研究组，男21例，女21例；年龄（42.7± 10.3）岁。3组的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

所有患者均在就诊后24 h内接受腰椎穿刺术，取脑脊液2 mL，3 000 r/min、4℃离心10 min，分离上清液，－20℃冰箱保存。采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测脑脊液标本中的ESAT-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平，严格按试剂盒说明书操作步骤进行。微孔被所用抗原包被后置37℃封闭4 h；弃掉孔中液体，在微孔中加入待测样本，每孔100 μL，37℃孵育60 min；弃上清后PBS清洗3次，加入酶标抗体，每孔100 μL，37℃孵育40-60 min；PBS清洗3次，加入TMB显色，37℃避光放置30 min；最后加入终止液终止反应后，使用美国Thermo公司生产的全自动多功能酶标仪在450 nm处测定吸收值（OD），根据标准曲线得出相应的浓度水平。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本吸收值的比值（P/N）表示，P/N≥2.1为阳性。ESAT-6试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；IL-10、TNF-α、IFN-γ试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0软件对数据进行分析，计量资料以（均数±标准差）表示，2组间比较采用独立样本t检验；灵敏度与特异度差异比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。指标之间的相关性分析采用Pearson相关分析，显著性水平＜0.05表示具有相关性。

2 结果

2.1 3组ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ比较

研究组与对照组的ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平均高于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；研究组的ESAT-6、TNF-α、IFN-γ水平与对照组相比明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；见表1。

表1 3组ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ比较（±s）

表1 3组ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ比较（±s）

注：与正常组比较，①P＜0.05；与对照组比较，②P＜0.05

组别 例数ESAT-6/(pg/mL)IL-10/(pg/mL)正常组对照组研究组35 29 48 5.9±1.2 7.2±1.8①243.7±103.4①②3.1±0.8 13.8±6.9①16.2±7.6①组别正常组对照组研究组TNF-α/(pg/mL) 5.4±2.9 10.6±4.1①88.3±34.6①②IFN-γ/(pg/mL) 7.3±2.7 29.2±17.6①98.3±41.2①②

2.2 各组ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ之间的相关性分析

相关性分析发现，对照组与正常组的ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ检测结果两两之间均无相关性；研究组的ESAT-6与IFN-γ水平呈正相关（r=0.96，P＜0.05）。

2.3 单一与联合检测的敏感度与特异性分析

4项指标联合检测的灵敏度明显高于使用ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ单一指标，差异均具有统计学意义（χ2=10.936，18.104，12.647，13.978；P＜0.05）。此外，联合检测的约登指数、阳性预测值和阴性预测值均高于单一指标，见表2。

3 讨论

表2 单一及联合指标的敏感度、特异性与约登指数比较

TBM是一种严重的肺外结核疾病，早期诊断及采取有效治疗措施对提高TBM的治疗效果和预后有重要意义[2]。目前TBM的诊断主要依靠观察临床表现、脑脊液结核杆菌培养或染色、头颅CT检查等手段，但由于很多患者存在症状不明显，结核杆菌培养时间长和阳性检出率低等问题，导致诊断率较低[3]。

近年来，多项研究发现一些蛋白和细胞因子在TBM发生发展过程中会产生显著变化。ESAT-6是由结核杆菌分泌产生的一种蛋白，在结核分支杆菌中能特异性表达，在卡介苗和大多数非结核分支杆菌中并不表达[4]。马江涛等[5]采用ELISA法检测发现TBM患者脑脊液中ESAT-6浓度明显高于非结核感染者。何俊瑛等[6]采用免疫组织化学法检测发现，TBM患者脑脊液单核细胞内的EAST-6检测灵敏度为70%，特异度达到95%。

INF-γ是由活化的T细胞和NK细胞生成的一种重要的免疫调节和促炎性细胞因子，具有双重的免疫作用，高浓度的INF-γ能加强免疫反应，但会加重中枢神经系统损伤；同时能够促进机体清除体内的结核分枝杆菌[7]。刘霞等[8]研究发现结脑患者急性期INF-γ表达水平明显升高，显著高于非中枢神经系统感染者。TNF-α是由活化的单核细胞产生的一种细胞因子，具有促炎症反应和调节免疫的功能；还可介导细胞凋亡，促进细胞再生。有研究发现，TNF-α具有广泛的生物活性，可有效抑制病毒、细菌，提高T细胞活性，诱发炎症反应[9]。本研究结果发现，TBM患者的ESAT-6、TNF-α、IFN-γ水平与非结核性中枢神经系统感染患者相比明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05），与上述研究结果基本一致。此外，本研究还发现TBM患者的ESAT-6与IFN-γ水平呈正相关，主要原因是INF-γ是由ESAT-6刺激淋巴细胞后分泌产生的重要抗原分子，INF-γ水平升高是ESAT-6水平升高的必然结果。

IL-10是一种由TH2细胞、巨噬细胞等分泌的一种免疫抑制因子，在炎症反应和免疫应答中发挥重要作用[10]。张韶斌等[11]研究发现结核患者的血浆、胸积水中的IL-10水平较正常人明显升高，IL-10通过抑制TH1细胞、巨噬细胞的免疫功能，导致有害细菌长期潜伏，患者病情不断加重。本研究结果显示，TBM患者与非结核性中枢神经系统感染患者的IL-10水平均明显高于普通头痛患者，与上述结果基本一致。

本研究采用的ESAT-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10这4项检测指标的最高灵敏度、特异度和约登指数分别为62.5%、82.9%和0.420，4项联合的灵敏度、特异度和约登指数分别为87.5%、74.3%和0.618，灵敏度和约登指数获得明显提高，提示4项联合检测能够提高阳性检出率，较单一检测效果更好，真实性更高。

综上所述，ESAT-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10在TBM患者脑脊液中的表达水平显著升高，对早期诊断TBM具有重要的临床价值，而且4项联合检测较单一检测的诊断效果更佳。

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（本文编辑：王晶）

Clinical Diagnostic Significance of ESAT-6,IL-10,TNF-α and IFN-γ in Tuberculous Meningi-tis

LIU Yong-li,LI Ming-wu,LAI Ming-hong,WANG Rong.
Department of Tuberculosis,Third People's Hospital of Kunming,Kunming 650041,China

Objective:To investigate the early secreting antigenic target-6(ESAT-6),tumor necrosis factor-α (TNF-α),interferon-γ(IFN-γ)and interleukin-10(IL-10)for early diagnosis of tuberculous meningitis(TBM).Methods:Forty-eight patients with TBM were enrolled as study group,29 non-tuberculous central nervous system infection patients were enrolled as control group,35 cases of normal headache patients were enrolled as normal group.The levels of ESAT-6,TNF-α,IFN-γand IL-10 levels in CSF of all patients were detected by ELISA method.Results:The levels of ESAT-6,TNF-α,IFN-γ and IL-10 of patients in the study group were significantly higher than those in the control group.The levels of ESAT-6,IL-10,TNF-αand IFN-γin the groups study and control group were significantly higher than those in the normal group(P＜0.05).It had significantly positive correlation between ESAT-6 and IFN-γ of patients in the study group(r=0.96,P＜0.05).The sensitivity of the combined detection of 4 indexes was significantly higher than that of one index(χ2=10.936,18.104,12.647, 13.978;P＜0.05).Conclusion:The levels of ESAT-6,TNF-α,IFN-γ and IL-10 in cerebrospinal fluid of TBM patients were significantly increased,which has important clinical value for early diagnosis of TBM.Four joint detection is better than the single detection of the diagnosis.

tubercular meningitis;early secreting antigenic target-6;interleukin-10;tumor necrosis factor-α;interferon-γ

R741；R651.1

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.04.014

昆明市第三人民医院结核二科昆明 650041

2016-04-19

刘永莉tiyanv@163.com