次氯酸伤口抗菌液体敷料的细菌内毒素检测方法探讨

刘茜 刘兴辰 严小莉 高静贤江苏省医疗器械检验所 （江苏 南京 210022）

次氯酸伤口抗菌液体敷料的细菌内毒素检测方法探讨

刘茜 刘兴辰 严小莉 高静贤＊江苏省医疗器械检验所 （江苏 南京 210022）

目的：探讨次氯酸伤口抗菌液体敷料的细菌内毒素检测方法。方法：依据《中华人民共和国药典》2015 年版1143 细菌内毒素检查法，考察次氯酸伤口抗菌液体敷料对细菌内毒素检查的干扰作用，确定其最大不干扰浓度。结果：次氯酸伤口抗菌液体敷料在稀释8倍时对细菌内毒素试验无干扰作用，其细菌内毒素限值符合规定。结论：使用鲎试剂检查次氯酸伤口抗菌液体敷料的细菌内毒素是可行的。

次氯酸伤口抗菌液体敷料 细菌内毒素

次氯酸作为抗菌剂，现已广泛用于牙科的抗菌治疗[1]。研究证明，即便是没有进行手术清创处理，只是用次氯酸冲洗溶液进行治疗，伤口也可很快恢复且不留疤痕，所以可以将次氯酸用于伤口抗菌处理[2]。本文参照《中华人民共和国药典》[3]2015年版1143细菌内毒素检查法，来确定次氯酸伤口抗菌液体敷料的细菌内毒素检查方法。

1.资料与方法

1.1 一般资料

样品：①次氯酸伤口抗菌液体敷料（0.01%次氯酸溶于（W/W）150mM氯化钠溶液），批号：16110811，国内某公司生产。②细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，规格：80EU/支，批号：150601-201681）。③细菌内毒素检查用水（以下简称BET水）（中国食品药品检定研究院，规格：5mL/支，批号：160006-201401；湛江安度斯生物有限公司，规格：100mL，批号：1609280）。④鲎试剂（以下简称TAL）（湛江安度斯生物有限公司，规格：0.1mL/支，批号：1606061，标示灵敏度：0.25EU/mL；福州新北生化工业有限公司，规格：0.1mL/支，批号：16040612，标示灵敏度：0.25EU/mL）。

仪器：混和器（天津药典标准仪器厂，ZH-2），细菌内毒素凝胶法测定仪（天津市天大天发科技有限公司，ET-96），洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2F），隔水式电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司，规格：GH6000），电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司，DHG-143BS-II）

1.2 方法

复核鲎试剂灵敏度：按《中华人民共和国药典》[3]2015年版1143细菌内毒素检查法复核TAL灵敏度。所用两个厂家的TAL标示灵敏度λ为0.25 EU/mL。

样品的最大有效稀释倍数：参照次氯酸伤口抗菌液体敷料的企业标准，及其他相关文献，本品内毒素限值定为2.0EU/mL[4,5]。样品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式进行计算：MVD=L/λ，其中L为次氯酸伤口抗菌液体敷料的细菌内毒素限值；λ为TAL标示灵敏度。目前市售TAL灵敏度一般在0.03～0.50EU/mL，则次氯酸伤口抗菌液体敷料的对应有效稀释倍数为：MVD0.5=2/0.5=4倍；MVD0.25=2/0.25=8倍；MVD0.125=2/0.125=16倍；MVD0.06=2/0.5=32倍；MVD0.03=2/0.03=64倍。所以样品在对应不同灵敏度TAL时的最大有效稀释倍数分别为4、8、16、32、64倍。

干扰试验预试验：将样品用BET水稀释成4、8、16、32、64倍。用系列稀释溶液加入细菌内毒素标准溶液，使不同稀释倍数溶液中均含有2λ浓度（0.5EU/mL）的内毒素[3,6]。每一浓度设两管，与灵敏度为0.25 EU/mL的TAL进行反应，设阴性（NC）和阳性（PC）对照管，混匀后封口，37˚C恒温60 min。

正式干扰试验：按《中华人民共和国药典》[3]2015年版1143进行正式干扰试验，分别用BET水及样品8倍稀释液将细菌内毒素工作标准品配制成浓度为2λ、λ、0.5λ、 0.25λ的溶液，每一浓度设四管，与灵敏度（λ）为0.25 EU/mL的TAL进行反应，设BET水阴性（NC）和样品阴性（NPC）对照管，混匀后封口，37˚C恒温60 min。

样品检测：将样品用BET水制成8倍稀释液，用此浓度稀释液将内毒素标准品稀释为2λ浓度的溶液，作为样品阳性对照，用灵敏度（λ）为0.25EU/mL的TAL按《中华人民共和国药典》[3]2015年版1143进行细菌内毒素检查。

2.结果

2.1 鲎试剂灵敏度的复核

TAL灵敏度试验结果见表1。

2批TAL的λc均在0.5～2.0λ，表明2批TAL灵敏度均符合规定，可用于细菌内毒素检查，并以λ作为该批TAL的灵敏度。

2.2 干扰试验预试验

试验结果见表2。

表1. 灵敏度复核结果

表2. 干扰预实验结果

表3. 正式干扰试验的结果

表4. 银离子伤口敷料的细菌内毒素检查结果

预试验结果显示，样品浓度在4倍稀释时对TAL与内毒素的反应有抑制作用，样品浓度在8～64倍的稀释范围内对TAL与内毒素的反应无干扰。笔者选用2个厂家的TAL进行比较，证明不同厂家的样品结果一致。

2.3 正式干扰试验

试验结果见表3。

结果表明，选用两个厂家的TAL，8倍的样品稀释液均无干扰作用。Es（用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值）均在0.5～2.0λ，Et（用样品稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值均）在0.5～2.0Es，说明样品8倍稀释液对细菌内毒素试验无干扰作用，该样品可以采用细菌内毒素检查法进行检测。

2.4 样品检测

试验结果见表4。

结果表明，该样品的细菌内毒素检查是符合规定的，即样品中的细菌内毒素含量小于2EU/mL。

3.讨论

热原试验是用于检测医疗器械或材料浸提液安全性评价的重要试验之一。热原试验常用的两种方法是细菌内毒素检查法和家兔法[7]。细菌内毒素检查法相对于家兔法具有灵敏度高、重现性好、快速简便等优点。但样品能否采用细菌内毒素检查法的先决条件之一是样品经过一定处理条件下，在满足限度检查要求的浓度下不干扰鲎试剂与内毒素产生特异性凝聚反应。

在进行干扰试验时发现样品浓度在4倍稀释时对TAL与内毒素的反应有干扰，样品浓度在8～64倍的稀释范围内对TAL与内毒素的反应无干扰，说明可以通过稀释法避免对细菌内毒素法的干扰作用[8]。所以可以用本方法来次氯酸伤口抗菌液体敷料的细菌内毒素含量。

[1] 马楠, 仇丽鸿. 次氯酸钠影响牙本质黏结的研究进展[J]. 中国实用口腔科杂志, 2016,9(9):570-573.

[2] Crew J, Varilla R, Rocas TA, et al. Treatment of Acute Necrotizing Fasciitis Using Negative Pressure Wound Therapy and Adjunctive Neutro Phase Irrigation Under theFoam[J]. Wounds, 2013,25(10):272-277.

[3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2015年版四部[M]. 北京:中国医药科技出版社, 2015:154-157.

[4] GB/T16886.12-2005,医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品[S]. 北京:中国标准出版社, 2005.

[5] 陈丹丹, 付海洋, 付步芳. 纳米银妇女外用抗菌凝胶的细菌内毒素检测[J]. 生物医学工程与临床, 2010,14(4):282-284.

[6] 王欣放. 清开灵注射液细菌内毒素检查法的建立[J]. 中国当代医药, 2012,19(21):81-83.

[7] 邹文, 袁暾, 蔡永福, 等. 家兔法与内毒素法检查生物材料热原的适用性研究[J]. 生物医学工程研究, 2011,30(3):155-158.

[8] 何进, 高军, 陈金旺. 凝胶法细菌内毒素检查的干扰因素及消除[J]. 中国药师, 2010,13(2):284-287.

Bacterium Endotoxin Test for Hypochlorite Wound Antisepti Dressing

LIU Qian LIU Xing-chen YAN Xiao-li GAO Jing-xian＊Jiangsu Province Institute for MedicaL Equipment Testing (Jiangsu Nanjing 210022)

Objective: To research the reviewed method of bacterium endotoxin test method for hypochlorite wound antisepti dressing. Method: The bacterium endotoxin tests were performed to detect valid dilution concentration and limit value according to the Chinese Pharmacopoeia 2015 edition. Result: The diluent of sample which was diluted 8 times didn’t disturb the bacterium endotoxin test and the limit value accord with demand. Conclusion: This method of bacterial endotoxin detection can ensure that hypochlorite wound antisepti dressing meet the requirements.

hypochlorite wound antisepti dressing, bacterium endotoxin

1006-6586(2017)11-0061-03

R197.39

A

2017-03-02