严重生精障碍男性精子DNA碎片指数及Hcy水平的研究分析

何海洪??郭伟权??柯娟玉??兰希??吴润安??周义文

[摘要] 目的 探讨同型半胱酸、精子DNA碎片指数与严重生精障碍男性的精子计数之间的相关性研究。 方法 2015年12月～2017年2月期间在医院就诊的严重生精障碍男性患者56例，按WHO标准分为严重无、少精子症组25例和弱精子症组31例，对照组为无生育障碍的男性27例。对所有纳入研究者进行精子参数、精子DNA碎片指数和血清Hcy水平的检测。结果 严重生精障碍男性的精子DNA碎片指数和Hcy均高于正常对照组。精子DNA碎片指数与血清Hcy水平、精子浓度呈正相关，而Hcy水平和精子浓度呈负相关。结论 Hcy水平和精子DNA碎片指数的升高，可能是严重生精障碍男性的重要病因，但其具体机制有待进一步研究。

[关键词] 男性；精子DNA碎片指数；同型半胱氨酸；精子

[中图分类号] R698.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）11-14-04

Research and analysis of sperm DNA fragmentation index and Hcy level of males with severe spermatogenesis dysfunction

HE Haihong GUO Weiquan KE Juanyu LAN Xi WU Run'an ZHOU Yiwen

Clinical Laboratory Center， Shenzhen Hospital of Southern Medical University， Shenzhen 518110， China

[Abstract] Objective To explore research on correlation between homocysteine， sperm DNA fragmentation index and sperm count of males with severe spermatogenesis dysfunction. Methods 56 male patients with severe spermatogenesis dysfunction who were treated in our hospital from December 2015 to February 2017 were selected. According to WHO standard， they were divided into the severe azoospermia and oligospermia group with 25 cases and the asthenospermia group with 31 cases. In the control group， there were 27 males without fertility barrier. Sperm parameters， sperm DNA fragmentation index and serum Hcy level of all included research objects were detected. Results Sperm DNA fragmentation index and Hcy level of males with severe spermatogenesis dysfunction were both significantly higher than those of the normal control group. Sperm DNA fragmentation index was positively correlated with serum Hcy level and sperm concentration while Hcy level was negatively correlated with sperm concentration. Conclusion Improvements of Hcy level and sperm DNA fragmentation index may be the main causes for males with severe spermatogenesis dysfunction but concrete mechanism needs to be further studied.

[Key words] Males； Sperm DNA fragmentation index； Homocysteine； Sperm

在發达国家大约有8%～10%的夫妇患有不育症，而发展中国家的数据更高，有研究报道国内不育率达到18%[1]，在这些不育夫妇中大约有30%～55%是由于男方因素造成的[2]。在男性生殖领域，精子发生是一个复杂的过程，受感染、性激素失衡、吸烟、饮酒、染色体异常、Y染色体微缺失、易位、囊性纤维化跨膜传导调节因子基因突变和其他的遗传因素等多种因素的影响[3]。近年来，国外一些研究发现，严重生精子障碍男性的同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）浓度明显高于正常男性，同时证实精液中的Hcy水平升高可以损害精子的质量并引起出生缺陷[4-5]。而国内却鲜见Hcy和严重生精障碍男性的相关性研究。有研究表明，精子DNA碎片和不明原因的不育男性密切相关[6]，也有研究[7]表明，精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）和精子常规各参数之间没有相关性，有学者却得出相反的结果[8]，因此精子DNA碎片指数和与精液密度、精子活力、存活率、畸形率等参数的相关性存在争议。

本次研究旨在研究严重生精障碍男性的精子DFI和血清Hcy水平，以及精子DFI、Hcy水平与精液参数之间的关联性的研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2015年12月～2017年2月期间，按WHO男性不育推荐标准[9]，收集南方医科大学深圳医院遗传生殖、泌尿外科门诊的精液标本，纳入研究者共56例，被分为两组：严重无、少精子症组（SOM组）[<5×106 个/mL，n=25，年龄（30.0±7.1）岁]和弱精子症组（OAT组）[5～20×106 个/mL，n=31，年龄（31.0±7.7）岁]。正常对照组（NM组）为无生育障碍的男性共27例，年龄为（29.0±6.1）岁，已知的遗传因素包括严重生精障碍原因的个体（染色体异常、Y染色体AZF微缺失等），不良的生活方式因素（酗酒、吸烟、职业等），以及临床因素（精索静脉曲张、隐睾等）排除在本次研究外。纳入研究的对象均知情同意。

1.2 试剂与仪器

美国哈密尔顿-索尼 HAMILTON THORNE IVOSⅡ型电子计算机全自动精液分析仪（CSA）及原装进口的耗材，罗氏Cobas 8000 全自动生化流水线，HCY检测用罗氏原装试剂盒，采用珠海BASO Diff-Quik法精子形态学快速染色试剂盒、深圳博锐德生物科技有限公司生产的精子DNA碎片检测试剂盒。

1.3 血清Hcy水平检测

BD真空促凝采血管采集血液，自然凝固，3500 r/min，分离血清，罗氏Cobas 8000自动生化流水线检测。按照试剂盒说明书，Hcy参考区间为4.5～13.6?mol/L，批内和批间不精密度变异系数不超过4%。

1.4 精液参数和DFI分析

采集精液前，要求患者禁欲2～7d，运用美国哈密尔顿HAMILTON THORNE IVOSⅡ型电子计算机全自动精液分析仪（CSA）检测精子浓度，精子总活力，精子存活率等项目，运用WHO推荐的Kruger标准[10]，运用Diff-Quik法检测精子畸形率，运用精子染色质扩散法（sperm chromatin dispersion，SCD）检测精子DFI，正常参考范围为小于25%。

1.5 统计学分析

各组间精子参数、HCY水平和精子DFI指数数据分析采用Mann-Whitney和Kruskall Wallis的非参数检验，采用box-whisker箱式图进行中位数比较，采用Passing-Bablok线性回归分析进行相关性分析，对不符合Passing-Bablok线性回归分析的采用散点线性趋势分析图，P<0.05为差异有统计学意义，所有数据分析均采用Medcalc统计分析（12.0版本）。

2 结果

2.1 各组间精子参数、精子DFI和Hcy水平比较

比较严重无、少精子症组（SOM组）和弱精子症组（OAT组）之间的存活率（t=0.532，P=0.5971）、精子DFI（t=-0.590，P=0.5579）和Hcy水平（t= -0.968，P=0.3357），差异无统计学意义（表1）。由于精子存活率、DFI和Hcy水平在SOM组和OAT之间没有差异，所以本研究令两个组别数据合并与正常对照组比较分析，运用box-whisker箱式图进行中位数比较（图1），精子存活率和DFI对照人群明显高于精子异常人群，而Hcy水平则相反。

2.2 精子DNA碎片指数、Hcy水平和精子浓度相关性分析

分析精子DFI与精子浓度以及精子Hcy和精子DFI的的相关性，采用Passing-Bablok回归分析，回归方程分别为：Y=21.071+0.286X，Y=10.705+0.053X，说明精子DFI與精子浓度、血清Hcy水平均呈正相关，而Hcy水平和精子浓度研究采用散点线性回归分析，发现Hcy水平越高，精子浓度则越低（图2）。

3 讨论

同型半胱氨酸是体内含硫氨基酸之一，是甲硫氨酸循环和半胱氨酸代谢的重要中间产物，其本身不参加蛋白质的合成，尤其在叶酸代谢过程环节发生问题时，会引起Hcy堆积，从而导致高同型半胱氨酸血症，进而对机体产生一系列有害影响，甚至会影响男性的生殖系统[11]。叶酸参与DNA的合成，精子DFI是反应精子DNA受损的最直接指标，研究表明，精子DNA损伤会对自然生育，辅助生殖技术治疗结局产生负影响，并与复发性流产有关，甚至有可能导致胎儿畸形率升高[12-13]。精子DFI、Hcy水平在不明原因的严重生精障碍患者中的比例是否存在密切关系，以及它们之间是否存在相关性，缺乏相关数据。

本次研究表明，精子存活率、精子DFI和Hcy水平在严重无、少精子症组（SOM组）和弱精子症组（OAT组）之间比较，统计学无差异。遂合并SOM组和OAT组与正常对照组进行箱式图比较分析，精子畸形率和精子DFI两个项目的结果在对照人群中明显高于精子异常人群，而Hcy水平则相反，说明精子DFI、Hcy和精子浓度存在一定关系。进而对精子DFI和精子浓度进行Passing-Bablok回归分析，发现精子DFI和精子浓度呈正相关，说明精子的DNA损伤越大和精子的数量越低，与孙超等[8]研究结果一致。而血清Hcy水平和精子浓度存在负相关，表明精子浓度越低，Hcy水平越高，戈一峰等[14]的研究一致。由于Hcy和精子DFI和精子浓度都存在一定的相关性，为了进一步明确Hcy和精子DFI是否存在相关性，继续对Hcy和精子DFI进行相关行研究，发现随着Hcy的缓慢升高，精子DFI出现了较为明显的升高，说明精子DFI的改变对Hcy较为敏感。分析其中的原因，可能由于高Hcy使抗氧化物酶的活性受到抑制，同时生成过多的ROS，这使精子细胞，以及细胞内蛋白质甲基化反应，造成精子发生的减少[15]。而氧化应激是精子DNA损伤发生的其中机制之一，ROS的产生超过了抗氧化物的清除能力，使精子DNA受到ROS的攻击，导致精子DNA的严重损伤[16]。但是要明确精子DNA损伤和精子发生减少，是否和Hcy升高导致的ROS升高的机制有关，还需要更加确凿的证据。

严重生精障碍男性的精子DFI和Hcy水平均和正常对照组存在差异，因此，精子DFI和Hcy水平升高是不明原因严重生精障碍男性患者的重要病因，这两个项目的可作为这类患者的重点监测指标，但是它们升高的机理还有待进一步的研究。

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（收稿日期：2017-03-31）