异烟肼对人肝细胞CYP1A1启动子区甲基化的影响

牛琛，张一杨，李金凤，李莹淑，李玉红，田慎谦，王悦，冯福民(华北理工大学公共卫生学院，河北唐山063000)



·论著·

异烟肼对人肝细胞CYP1A1启动子区甲基化的影响

牛琛，张一杨，李金凤，李莹淑，李玉红，田慎谦，王悦，冯福民
(华北理工大学公共卫生学院，河北唐山063000)

目的 观察异烟肼对人肝细胞细胞色素P4501A1(CYP1A1)启动子区CpG岛甲基化的影响，探讨异烟肼致肝细胞损伤的机制。方法 将肝细胞分为观察组和对照组，观察组分别加入200、400、800 μg/mL异烟肼，对照组加入同体积含DMSO的培养液。采用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞培养上清液中的LDH水平来观察细胞损伤情况，实时荧光定量PCR方法检测细胞CYP1A1、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b mRNA的相对表达量，酶联免疫吸附法检测细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白水平，采用亚硫酸盐修饰后测序法检测CYP1A1启动子区甲基化状态。结果 观察组细胞培养上清液中的LDH水平均高于对照组，800 μg/mL异烟肼组最高(P均<0.05)。与对照组比较，观察组随异烟肼浓度升高，CYP1A1 mRNA表达呈先升高后降低趋势，差异均有统计学意义(P均<0.05)；DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA和蛋白表达均随异烟肼浓度升高而升高，800 μg/mL异烟肼组高于其他组(P均<0.05)。细胞CYP1A1基因启动子区甲基化率为82.9%，高于对照组的79.6%(P<0.05)。结论 异烟肼可导致肝细胞CYP1A1基因启动子区高甲基化，进而引起肝细胞损伤。

异烟肼；药物性肝损伤；细胞色素P4501A1;DNA甲基化；乳酸脱氢酶；DNA甲基转移酶；人肝细胞

异烟肼(INH)是WHO推荐的标准抗结核一线药物，临床广泛用于治疗结核病。但长期用药和不规范用药均可引起肝脏损伤[1]。体内Ⅰ相、Ⅱ相反应参与了异烟肼的代谢过程，细胞色素P450(CYP450)是参与Ⅰ相反应的主要酶系[2]，在代谢过程中发挥重要作用[3]。CYP1A1是CYP450家族成员，CYP1A1基因启动子区高甲基化可能在抗结核药物性肝损伤的过程中发挥作用[8]。甲基化是表观遗传学的一部分，指由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下，将甲基转移到胞嘧啶的过程[4]。基因启动子区的甲基化能够调控目的基因的表达[5]，从而影响疾病的发生发展。研究发现，甲基化作用与肝纤维化[6]、急慢性乙型肝炎[7]、肝癌[8]、脂肪肝[9]等疾病的发生发展有关。当细胞受到外界刺激时，细胞内乳酸脱氢酶(LDH)会进入细胞外，因此检测细胞培养液中的LDH可反映细胞损伤[10]。DNMT是DNA甲基转移酶，通过检测细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表达可反映细胞的甲基化状态。2016年10～11月，我们使用异烟肼处理人肝细胞，观察细胞的损伤情况和细胞CYP1A1基因启动子区CpG岛甲基化状态，探讨异烟肼致肝损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝细胞HL-7702购自上海中科院。异烟肼、二甲基亚砜(DMSO)购自日本TCI公司，RPMI1640、胎牛血清、青霉素与链霉素分别购自CORNING、CLARK、BI公司，反转录试剂盒和SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自TaKaRa公司，乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自南京建成，Heraeus高速离心机，C1000 PCR扩增仪，荧光定量RCR仪。

1.2 细胞培养与分组处理 人肝细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素、90% RPMI1640培养液于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，细胞长满后用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞，消化悬浮，加入培养液制成1×105/mL的细胞悬液，接种到6孔板中。将细胞分为两组，预培养24 h后，异烟肼组分别加入200、400、800 μg/mL异烟肼，每个浓度设6个复孔，对照组加入同体积含DMSO的培养液。培养6 h后收获细胞。

1.3 细胞培养上清液中LDH水平检测 取20 μL细胞培养上清液，使用LDH检测试剂盒测定LDH活性。

1.4 细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA检测 采用实时荧光定量PCR方法。采用TRIzol法提取RNA，逆转录合成cDNA。逆转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min。CYP1A1上游引物5′-CTCTTTGGAGCTGGGTTTGAC-3′，下游引物5′-GCTGTGGGGGATGGTGAA-3′；DNMT1上游引物5′-ACCTGGCTAAAGTCAAATCC-3′，下游引物5′-ATTCACTTCCCGGTTGTAAG-3′；DNMT3a上游引物5′-CAGCTTCCACGTTGCCTTCT-3′，下游引物5′-CATCTGCAAGCTGTCTCCCTTT-3′；DNMT3b上游引物5′-TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG-3′，下游引物5′-AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCCCCTCCTCACAGTTGC-3′，下游引物5′-AAGCCGAGACGACGACAGAC-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共40个循环。以GAPDH基因为内参，目的基因的相对表达量采用目的基因校正相对表达量2-ΔΔCt公式进行计算。实验重复3次。

1.5 细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白检测 采用酶联免疫吸附法。取对数生长期细胞，加入细胞裂解液提取蛋白，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体，用封板膜封住反应孔，37 ℃水温育60 min。弃去液体，洗板。加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入终止液终止反应。于450 nm波长处测定各孔OD值。在Excel工作表中绘制标准曲线，以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.6 CYP1A1基因启动子区CpG岛甲基化检测 采用亚硫酸盐修饰后测序(BSP)法。使用DNA提取试剂盒提取细胞DNA，委托上海生工生物工程公司使用甲基化测序分析软件(QUMA)进行甲基化测序。

2 结果

2.1 两组细胞培养上清液中LDH水平比较 200、400、800 μg/mL异烟肼组和对照组细胞培养上清液中LDH水平分别为(288.10±35.20)、(366.14±63.05)、(515.25±86.21)、(236.84±14.51)U/L。随异烟肼浓度升高，LDH逐渐升高，800 μg/mL异烟肼组LDH水平高于其他各组(P均<0.01)。

2.2 两组细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达比较 见表1。与对照组比较，400、800 μg/mL异烟肼组DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达均升高(P均﹤0.05)，其中800 μg/mL异烟肼组DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达高于其他各组(P均﹤0.01)。

表1 两组细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达比较

注：与对照组比较，#P<0.05，*P<0.01。

2.3 两组细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白水平比较 见表2。与对照组比较，400、800 μg/mL异烟肼组DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达均升高(P均﹤0.05)，其中800 μg/mL异烟肼组DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达高于其他各组(P均﹤0.01)。

表2 各组细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表达比较

注：与对照组比较，#P<0.05，*P<0.01。

2.4 两组细胞CYP1A1 mRNA表达比较 200、400、800 μg/mL异烟肼组细胞CYP1A1 mRNA相对表达量分别为1.15±0.51、0.78±0.12、0.52±0.19。与对照组的1.00±0.00相比，200 μg/mL异烟肼组CYP1A1表达升高(P<0.05)；400、800 μg/mL异烟肼组降低(P均<0.01)，800 μg/mL异烟肼组最低。

2.5 两组细胞CYP1A1启动子区CpG岛甲基化水平比较 为了明确CYP1A1 mRNA表达是否受启动子区的甲基化调控，本研究选取细胞损伤最严重、DNMT升高最明显、CYP1A1 mRNA降低最明显的800 μg/mL异烟肼组和对照组进行甲基化测序。结果显示，对照组CYP1A1启动子区甲基化率为79.6%，异烟肼组CYP1A1启动子区甲基化率为82.9%，异烟肼组高于对照组(P<0.05)。

2.6 LDH与CYP1A1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达的相关性 相关性分析显示，LDH与CYP1A1 mRNA表达呈负相关(r=-0.814，P<0.01)，与DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达呈正相关(r分别为0.661、0.815、0.475，P均<0.05)。

3 讨论

研究发现，异烟肼可被CYP450家族代谢为有毒产物，导致肝脏损伤[11]。本研究显示，向肝细胞中加入不同浓度异烟肼后，细胞培养液中的LDH水平均高于对照组，800 μg/mL异烟肼组最高，细胞损伤最严重。

胃癌、肺癌中DNMT呈高表达[12]。DNMT1不但能参与甲基化状态的维持和非CpG位点从头甲基化，还与甲基化的延伸有关；DNMT3a、DNMT3b主要参与到启动子区甲基化修饰的过程中[13]。这三种DNMT的变化从侧面反映了甲基化过程中的变化[14]。本研究显示，随着异烟肼作用浓度的升高，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA和蛋白表达也随之升高，提示DNMT活性升高可能会使甲基化的作用加强。相关性分析显示，LDH与DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达呈正相关，提示细胞损伤越严重，DNMT在细胞内参与甲基化的作用越强。

CYP1A1是CYP450家族成员之一。CYP1A1与肺癌相关性的报道较多，但异烟肼引起肝损伤的报道较少，尤其是CYP1A1启动子区甲基化与异烟肼致肝损伤的关系。CYP1A1作为CYP450酶系家族成员，在Ⅰ相反应中发挥重要作用，也是肝癌、子宫平滑肌瘤和食管癌的危险因素[15～17]。有研究[18]表明，将CYP1A1野生型小鼠和基因缺陷型小鼠暴露于高氧环境中，经过一段时间饲养后取肺组织检测其损伤和炎性因子变化;结果显示,CYP1A1缺陷型小鼠与野生型小鼠相比肺部组织和血管水肿加重并且炎性因子升高，说明CYP1A1基因缺陷型小鼠肺部更容易受到高氧诱导的损伤，提示CYP1A1缺失可能增加氧化应激的敏感性。本研究结果显示，人肝细胞中CYP1A1 mRNA表达随异烟肼浓度的升高呈先升高后降低的趋势，说明高剂量异烟肼能够降低CYP1A1表达。相关性分析结果显示，LDH与CYP1A1的表达呈负相关，说明细胞损伤越严重CYP1A1 mRNA降低越明显。另一方面，随着DNMT表达升高，提示细胞中甲基化作用加强，而CYP1A1表达的降低又暗示可能受甲基化作用的调控。我们根据LDH、CYP1A1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b结果，选择变化最明显的800 μg/mL异烟肼组进行CYP1A1启动子区甲基化测序。结果显示，异烟肼组甲基化率为82.9%，高于对照组。说明异烟肼通过提高DNMT表达，增加CYP1A1启动子区的甲基化。

综上所述，异烟肼对人肝细胞具有损伤作用，高浓度异烟肼的损伤作用更强；随着细胞损伤加重，DNMT表达随之升高，提示异烟肼可改变细胞内的甲基化状态；经过测序检测发现异烟肼组CYP1A1启动子区甲基化升高，与之对应的CYP1A1 mRNA表达降低，提示CYP1A1启动子区甲基化的升高降低了mRNA表达。因此认为，CYP1A1基因启动子区高甲基化与异烟肼致肝细胞损伤有关。

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摘自《中国学术期刊(光盘版)检索与评价数据规范》(修订版CAJ-CD B/T 1-2006)

Effect of isoniazid on methylation of CYP1A1 promoter region of human hepatic cells

NIUChen,ZHANGYiyang,LIJinfeng,LIYingshu,LIYuhong,TIANShenqian,WANGYue,FENGFumin

(SchoolofPublicHealth,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To observe the effect of isoniazid on methylation of CpG island in cytochrome P4501A1 (CYP1A1) promoter region of human hepatocytes and to explore the mechanism of isoniazid-induced hepatocyte injury. Methods Liver cells were divided into the experimental group and control group. Cells in the experimental group were treated with 200, 400, and 800 μg/mL isoniazid, respectively. Cells in the control group were added with the same volume of DMSO culture medium. The LDH level in the supernatant was measured by lactate dehydrogenase (LDH) assay kit. The relative expression of CYP1A1, DNA methyltransferase 1 (DNMT1), DNMT3a, and DNMT3b mRNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The protein levels of DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The methylation of CYP1A1 promoter was detected by bisulfite sequencing PCR. Results The level of LDH in the supernatant of the experimental group was higher than that in the control group, and the LDH level was the highest in the 800 μg/mL isoniazid group (allP<0.05). Compared with the control group, the expression of CYP1A1 mRNA in the experimental group first increased and then decreased with the increasing concentrations of isoniazid (allP<0.05). DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b mRNA and protein expression increased with the increase of isoniazid concentration, and the 800 μg/mL isoniazid group was the highest (P<0.05). The methylation rate of CYP1A1 gene promoter region was 82.9%, which was higher than that of control group (79.6%) (P<0.05). Conclusion Isoniazid can cause human hepatocyte injury, and the mechanism may be related to CYP1A1 gene promoter hypermethylation.

isoniazid; drug-induced hepatic injury; cytochrome P4501A1; DNA methylation; lactate dehydrogenase; DNA methyltransferase; human hepatic cells

国家自然科学基金资助项目(81041096)。

牛琛(1992-)，男，硕士研究生，主要研究方向为传染病的防治。E-mail: 1737147219@qq.com

冯福民(1963-)，男，教授，博士生导师。主要研究方向为传染病的防治。E-mail: fm_feng@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.001

R525

A

1002-266X(2017)26-0001-04

2017-02-18)

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