固相萃取柱净化-液相色谱-串联质谱法测定糕点中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物和玉米赤霉烯酮

王丽娟,柯润辉,*,安红梅,尹建军,宋全厚 (1.中国食品发酵工业研究院,北京 100015; 2.国家食品质量监督检验中心,北京 100015)



固相萃取柱净化-液相色谱-串联质谱法测定糕点中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物和玉米赤霉烯酮

王丽娟1,2,柯润辉1,2,*,安红梅1,2,尹建军1,2,宋全厚1,2
(1.中国食品发酵工业研究院,北京 100015; 2.国家食品质量监督检验中心,北京 100015)

建立使用超高效液相色谱-串联质谱仪测定糕点中玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及其衍生物3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-AcDON)4种真菌毒素的方法。该方法在4 min内完成4种真菌毒素的分析,线性范围5～1000 μg/kg,标准曲线的相关系数均在0.997以上,DON、ZEN的最低检出限为1.0 μg/kg,3-AcDON、15-AcDON的最低检出限为1.5 μg/kg。通过对134份市售预包装糕点样品进行分析发现，4种真菌毒素均有一定检出,其中ZEN、DON、3-AcDON和15-AcDON的检出率分别为2.2%、78.4%、3.0%和5.2%,所有样品中4种真菌毒素含量水平均未超过食品安全国家标准限量要求。

固相萃取,液相色谱-串联质谱仪,真菌毒素,糕点

真菌毒素广泛存在于世界各地的谷物及其加工产品当中,极大地影响到这些产品的经济价值并对人畜健康造成潜在危害。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是污染范围最广的两种镰刀菌毒素,会通过食物链在人体或动物体中蓄积,造成对机体的危害,是影响食品安全的重要因素[1-2]。DON及其衍生物3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Acetyl deoxynivalenol,3-AcDON)和15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Acetyl deoxynivalenol,15-AcDON)具有极性毒性、免疫毒性、细胞毒性、生殖毒性和三致作用[3-4],目前已被联合国粮农组织和世界卫生组织确定为最危险的自然发生食品污染物之一。ZEN是具有雌激素作用的真菌毒素,通过食物链进入人和动物体,并在机体内蓄积,产生多种雌激素效应综合症状,甚至引起致癌和致畸[1]。

我国作为粮食生产大国,是受真菌毒素污染比较严重的国家之一。由于受气候因素和农户个体种植、贮藏方式的影响,我国主要粮食作物易受镰刀菌毒素污染。尤其是南方高温高湿地区、长江中下游地区,梅雨季节有利于霉菌生长及产毒,小麦、玉米等较普遍受到镰刀菌毒素的污染,DON和ZEN的污染程度更是常超我国的限量标准[5-8]。食品中真菌毒素污染问题一直是备受关注的食品安全热点,但国内相关研究多集中在小麦、玉米、花生等粮油及其加工产品上,而糕点作为一种以粮、油、糖、蛋等为主要原料加工而成的食品,其真菌毒素的残留情况一直未受关注,目前关于糕点中真菌毒素污染水平数据十分欠缺。

真菌毒素的检测方法很多,有生物鉴定法、化学分析法、仪器分析法和免疫分析法等[9-12],其中免疫亲和柱或多功能柱净化,液相色谱或液相色谱-串联质谱测定的方法在食品中真菌毒素的分析中得到了广泛的应用[13-16]。免疫亲和柱净化效果好,但通常只适用于单种毒素,通用性较差,且价格昂贵,使用成本高[17-18]。多功能净化柱适用于多种毒素,操作简单,但对复杂基质的样品净化效果不佳。固相萃取作为一种成熟、稳定的样品前处理技术,主要作用是降低样品基质干扰、富集目标物质、提高检测灵敏度,在食品安全检测中得到了广泛的应用。本研究采用固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱法同时检测糕点中DON、3-AcDON、15-AcDON和ZEN 4种真菌毒素残留,并应用此方法分析134份市售糕点中4种真菌毒素残留情况,以期为今后更全面深入的研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品 超市、集市及网购的包括蛋糕、饼干、麻花、锅巴等在内的134份预包装糕点(包括热加工糕点93份和冷加工糕点41份);脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮 纯度≥98%,美国Sigma公司;甲醇、乙腈、正己烷为色谱纯 美国J T Baker公司;实验用水 为经Milli-Q Reference净化系统过滤的去离子水;其他试剂 分析纯。

Cleanert PEP固相萃取柱、Cleanert C18固相萃取柱 天津博纳艾杰尔科技有限公司；LCMS-8050超高效液相色谱-串联质谱仪 日本Shimadzu公司,具体配置为LC-20ADXR×2输液泵,DGU-20A3R在线脱气机,SIL-20AXR自动进样器,CTO-20AC柱温箱,CBM-20A系统控制器,LCMS-8050三重四极杆质谱仪,LabSolutions Ver. 5.72色谱工作站;Milli-Q Reference超纯水器 美国Millipore公司;KQ-500DE超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的制备 4种真菌毒素标准品分别用乙腈配制成100 mg/L的标准储备液,再用乙腈配制5 mg/L的混合标准溶液,于-18 ℃避光储存。

基质匹配标准溶液:选取不含4种待测真菌毒素的糕点作为空白样品,按1.2.2的方法处理,移取6份各1 mL空白样品提取液于10 mL刻度试管中,以弱氮气流吹至近干,分别加入一定量的4种真菌毒素混合标准溶液,再加甲醇-水(20∶80)溶液定容至1 mL,混匀,配制成5、10、20、100、500和1000 μg/kg的基质匹配标准溶液,经0.22 μm微孔滤膜过滤供LC-MS/MS分析。

1.2.2 样品前处理方法 准确称取粉碎均匀的样品粉末5.0 g(精确到0.01 g),置于40 mL塑料离心管中,加入乙腈20 mL,涡旋振荡3 min,超声10 min,浸泡过夜;9000 r/min离心10 min,上清液转移至100 mL鸡心瓶中,45 ℃旋蒸至干;加入3 mL 5%乙腈-水溶液(乙腈∶水=5∶95,体积比),再加入3 mL乙腈饱和的正己烷,涡旋2 min,充分溶解残渣,倒入10 mL塑料离心管中,6000 r/min离心5 min,弃去上层正己烷,下层水相待净化。

待净化液过3 mL甲醇和3 mL水活化好的Clenert PEP(60 mg/3 mL)固相萃取小柱,控制样品溶液滴落速度为1滴/s,1 mL蒸馏水淋洗小柱,负压抽干,3 mL甲醇洗脱并接收。洗脱液于45 ℃下氮气吹干,1 mL甲醇-水(20∶80)溶解,过0.22 μm滤膜,LC-MS/MS测定。

1.2.3 液相色谱条件 使用HALO C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,2.7 μm);流动相:A相-甲醇,B相-0.1%氨水溶液;流速:0.3 mL/min;梯度洗脱程序:0 min,甲醇的体积分数为10%;0～0.5 min,保持甲醇的体积分数为10%;0.5～2 min,甲醇体积分数由10%升至80%,并保持0.2 min;2.21 min,甲醇的体积分数从80%降至10%;2.21～4.0 min,甲醇的体积分数保持10%;柱温:40 ℃;进样体积:5 μL。

1.2.4 质谱条件 离子源:ESI(-);离子源接口电压:0.5 kV;雾化气:氮气3.0 L/min;干燥气:氮气10 L/min;碰撞气:氩气;DL温度:250 ℃;加热模块温度:400 ℃;扫描模式:多反应监测(MRM);驻留时间:15 ms;延迟时间:3 ms;4种真菌毒素标准品MRM参数:见表1。

1.3 数据处理

数据采集与处理通过仪器配套的Version 5.27软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 固相萃取柱的选择

固相萃取柱净化技术具有能够有效去除杂质、富集目标物的特点,在痕量分析中应用广泛。本实验分别考察了Cleanert PEP固相萃取柱和Cleanert C18固相萃取柱的净化吸附和浓缩效果。

表1 4种真菌毒素的化合物信息和MRM优化参数Table 1 The information of 4 mycotoxicns compounds and MRM optimization parameters

注:*表示定量离子。

结果表明:采用C18柱净化时,4种真菌毒素回收率较PEP柱低,4种真菌毒素在PEP柱中的保留效果更为理想(回收率均大于70%);另外,C18柱对色素等极性杂质的净化效果不好,净化液噪音较PEP柱净化液大,因此,本实验最终采用PEP柱净化。

2.2 质谱条件优化

图1 4种真菌毒素混合标准溶液的选择离子图Fig.1 Ior chromatograms for 4 mycotoxins注:A. DON;B. 3-AcDON;C. 15-AcDON;D. ZEN。

根据4种真菌毒素的分子结构特征,选择ESI-电离模式。取100 μg/L的4种真菌毒素混合标准溶液,不接色谱柱直接进样,采用单极质谱扫描,得到4种真菌毒素的母离子,利用仪器的自动优化功能,分别对Q1、Q3、CE等进行优化,确定4种真菌毒素的母离子和子离子,以强度较大的子离子作为定量离子,强度稍小的子离子为定性离子,各化合物的定量离子及定性离子见表1。

2.3 液相色谱条件优化

根据4种真菌毒素的理化性质,采用柱填料为C18的色谱柱,比较了50 mm和100 mm两种不同长度及1.7 μm和2.7 μm不同粒径色谱柱的分离效果,发现采用HALO C18(2.1 mm×50 mm,2.7 μm)时,4种真菌毒素的分离效果良好,分析时间短,峰形尖锐,保留时间适中,可满足4种真菌毒素的定量检测要求。

测定真菌毒素通常使用的流动相为乙腈-水或者甲醇-水[16],在流动相中加入一定量氨水、乙酸铵等适合负离子模式的盐,可显著提高待测物的离子化效率。通过比较不同流动相体系的分离效果,发现当用乙腈-10 mmol/L乙酸铵的水溶液为流动相时,样品色谱峰与其它杂质峰未能完全分离;当用甲醇-0.1%氨水为流动相时,待测组分达到较好的分离,最终确定甲醇-氨水体系作为流动相。进一步实验比较甲醇与0.05%、0.1%和0.2%的氨水作为流动相时,真菌毒素的测定效果,发现采用0.1%的氨水时,灵敏度和分离度均达到最好,故采用甲醇、0.1%氨水作为流动相。优化条件下4种真菌毒素的MRM质谱图见图1。

2.4 定量方法学评价

表2 4种真菌毒素的线性范围、线性方程、相关系数和检出限Table 2 Linear range,calibration curves,correlation coefficients(R2),and LOD of 4 mycotoxins

2.4.1 方法的线性范围和检出限 将5、10、20、100、500和1000 μg/kg浓度的基质匹配混合标准工作液按1.2中的分析条件进行测定,外标法定量。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制校准曲线。用空白糕点样品作为基质,添加5 μg/kg浓度水平的4种真菌毒素混合标准溶液后按1.2.2方法处理后重复测定,根据3倍信噪比计算最低检出限,校准曲线参数和方法最低检出限见表2。由表2可知,线性范围为5～1000 μg/kg,标准曲线的相关系数均在0.997以上。本方法的检出限(1～1.5 μg/kg)低于国标检出限[19-20],灵敏度更高。

表4 市售糕点样品中4种真菌毒素的检测结果(n=3)Table 4 Results of 4 mycotoxins residual in pastry samples(n=3)

2.4.2 方法的回收率和精密度 以空白糕点样品加标的回收率表示方法的准确度,以回收率的相对标准偏差(RSD)表示方法的精密度。向空白糕点样品中添加真菌毒素混合标准溶液,进行低、中、高3个水平的添加回收实验,按1.2.2节所述实验步骤进行处理和测定,进行6次重复实验,计算其回收率及相对标准偏差。结果表明,糕点中4种待测物的平均回收率在74.6%～92.8%之间,相对标准偏差小于3.6%(表3),方法的准确度和精密度均符合分析要求。

表3 糕点中4种真菌毒素的添加回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and precisions of 4 mycotoxins spiked in pastry(n=6)

2.5 实际样品分析

用建立的方法对134份糕点样品进行检测,结果(表4)发现:134份样品中DON的检出率为78.4%,最高为441.6 μg/kg,DON的平均含量为44.8 μg/kg;3-AcDON的检出率为3.0%,最高检出浓度为8.1 μg/kg;15-AcDON的检出率为5.2%,最高检出浓度为13.2 μg/kg;ZEN的检出率为2.2%,最高浓度为50.3 μg/kg。3-AcDoN、15-AcDON和ZEN的检出率明显低于DON,阳性样品总离子流图见图2。

图2 某阳性糕点样品检出真菌毒素总离子流谱图Fig.2 Total ion current of detected mycotoxins in one pastry sample

我国《GB 2761-2011 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中规定谷物及其制品中DON和ZEN的限量分别为1000 μg/kg和60 μg/kg。根据本研究的检测结果,所有样品均符合食品安全国家标准,处于安全水平,但它们在糕点产品中的存在值得引起重视,可采用更加有效的食品保存手段以防食品在储存时霉变。

3 结论

本文建立了一种固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱仪测定预包装糕点中4种真菌毒素的方法。该方法在4 min内完成4种真菌毒素的分析,线性范围5～1000 μg/kg,标准曲线的相关系数均在0.997以上,DON、ZEN方法最低检出限为1 μg/kg,3-AcDON、15-AcDON方法最低检出限为1.5 μg/kg,方法简便可靠,可满足行业标准分析、检测的需要。按照本方法对市售134份糕点样品进行分析,发现:4种真菌毒素均有一定检出,其中DON的检出率达78.4%,3-AcDoN、15-AcDON和ZEN的检出率明显低于DON,所有样品中4种真菌毒素含量水平均未超过食品安全国家标准限量要求。

[1]Zinedine A,Soriano J M,Molt J C,et al. Review on the toxicity,occurrence,metabolism,detoxification,regulations and intake of zearalenone-an oestrogenic mycotoxin[J]. Food and Chemical Toxicology,2007,45：1-18.

[2]Tutelyan V A. Deoxynivalenol in cereals in Russia[J]. Toxicology Letters,2004,153：173-179.

[3]Pestka J. Deoxynivalenol-induced IgA production and IgA nephropathy-aberrant mucosal immune response with systemic repercussions[J]. Toxicology Letters,2003,140：287-295.

[4]Sprando R L,Collins T F X,Black T N,et al. Characterization of the effect of deoxynivalenol on selected male reproductive endpoints[J]. Food and Chemical Toxicology,2005,43：623-635.

[5]陆刚,李李,薛英. 安徽省谷物及制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染调查[J]. 中华预防医学杂志,1994,28:27-30.

[6]李荣涛,谢刚,付鹏程,等. 小麦和玉米中玉米赤霉烯酮污染情况初探[J]. 粮食储藏,2004,5:36-38.

[7]王晓云. 2005年中国六省玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染调查[D]. 长春:吉林大学,2006.

[8]于宝柱. 2005年中国四省小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染调查[D]. 长春:吉林大学,2006.

[9]唐吉旺,周从,林源,等. 毛细管柱-气相色谱法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇含量[J]. 理化检验-化学分册,2012,48(12):1441-1443.

[10]肖娟,辛苑,冯莎,等. 酶联免疫吸附法测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇[J]. 食品安全质量检测学报,2013,4(1):224-227.

[11] 孙雪,郗存显,唐柏斌,等. 复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量[J]. 分析化学研究学报,2016,44(6):970-978.

[12]郭建,王郑平,曹阳,等. 高效液相色谱法测定粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇[J]. 粮食与食品开发,2014,21(6):87-89.

[13] 李向丽,谭贵良,梁波,等. 多功能柱净化-超高效液相色谱串联质谱法同时测定水产品中11种真菌毒素[J].现代食品科技,2015,31(7):342-346.

[14]Ren Y P,Zhang Y,Shao S L,et al. Simultaneous determination of multi-component mycotoxin contaminants in foods and feeds by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A,2007,1143:48-64.

[15]胡文彦,徐磊,杨军,等. 基于QuEChERS提取的快速液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿谷基辅助食品中的9种真菌毒素[J]. 色谱,2014,32(2):133-138.

[16]黄金凤,冼艳萍,李秀英,等. 分散固相萃取-液相色谱-串联xiao质谱法测定饼干中的6种玉米赤霉醇类化合物[J]. 现代食品科技,2014,30(12):241-246.

[17]李瑞园,刘红河,康莉. HPLC-MS/MS法同时测定粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物[J]. 分析测试学报,2014,33(6):660-665.

[18]李磊,李海畅,周贻兵,等. 液相色谱-串联质谱测定小麦粉中11种真菌毒素[J]. 食品研究与开发,2016,37(3):156-160.

[19]GB/T 23503-2009,食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法[S].

[20]GB/T 23504-2009,食品中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法[S].

Determination of deoxynivalenols and zearalenone in pastry by solid phase extraction coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WANG Li-juan1,2,KE Run-hui1,2,*,AN Hong-mei1,2,YIN Jian-jun1,2,SONG Quan-hou1,2

(1.China National Research Institute of Food & Fermentation Industries,Beijing 100015,China; 2.National Food Quality Supervision and Inspection Center,Beijing 100015,China)

A method for simultaneous determination of deoxynivalenol,3-Acetyl deoxynivalenol,15-Acetyl deoxynivalenol and zearalenone in pastry had been developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS). The determination was finished within 4 minutes. The results showed that all of the 4 mycotoxins had good linearity in the range of 5～1000 μg/kg with the correlation coefficients(R2)better than 0.997. The limits of detection(LODs)of DON and ZEN were 1.0 μg/kg,3-AcDON and 15-AcDON were 1.5 μg/kg. The results of 134 pastry samples determined by the method showed that all of the 4 mycotoxins were detected in the tested samples.The detection rate were 2.2%,78.4%,3.0% and 5.2% for ZEN,DON,3-AcDON and 15-AcDON. The maximum residual contents were lower than national food safety limited requiements.

solid phase extraction;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);mycotoxins;pastry

2016-12-14

王丽娟(1987-)，女，硕士研究生，工程师，研究方向：食品安全分析与检测技术，E-mail：wanglijuan8802@163.com。

*通讯作者:柯润辉(1980-)，博士，高级工程师，研究方向：食品安全分析与检测技术，E-mail:runhuike@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2017)14-0031-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.007