基于IR和PLS的银耳中亚硫酸盐快速定量检测

袁 凯 王锡昌 张 龙 谷东陈 郭小溪 樊震宇

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)



基于IR和PLS的银耳中亚硫酸盐快速定量检测

袁 凯 王锡昌 张 龙 谷东陈 郭小溪 樊震宇

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

采用红外光谱技术，通过探究亚硫酸盐残留量对银耳中特定化学官能团含量变化的影响，揭示银耳漂白机理，并基于二者的联系建立一种快速定量检测银耳中亚硫酸盐残留量的方法。模拟硫磺熏蒸工艺，制备不同亚硫酸盐含量水平的银耳样品，并通过碘滴法检测所制备样品中亚硫酸盐含量的真实值，收集不同样品的红外光谱图，分析谱图差异，从而建立基于偏最小二乘法(PLS)的定量检测模型。结果表明：硫磺熏蒸通过破坏维生素B2的羟基自由基从而实现漂白目的。且红外定量检测银耳中亚硫酸盐含量模型的R为0.980 4，RMSECV为0.97。该方法具有快速、定量和无损检测食品中亚硫酸盐的潜力。

亚硫酸盐；银耳；快速检测；红外光谱；偏最小二乘法；化学建模

银耳又称作白木耳、银耳子、雪耳等，是中国特有的真菌类食药原材料[1]。在银耳传统干制加工中，常常运用硫磺熏蒸这一工艺。硫磺熏蒸具有漂白和消毒作用，能减缓果蔬内部发生的一系列化学变色反应，同时能够抑制微生物的滋生[2-4]。但硫磺熏蒸工艺无法控制亚硫酸盐(以SO2计)的残留量，易导致亚硫酸残留量超标，危害人体健康，因此硫磺熏蒸这一传统工艺在中国被严格禁止[5]。但银耳市场中依旧存在以颜色判定质量的错误消费理念，刺激了某些不良商家仍采用这一高危害的加工技术制作超白银耳。

针对亚硫酸盐和二氧化硫在食品及药材中残留的问题，各国相继制定出系列规定和标准，同时研究并建立其检测方法，国际上常采用MW法(Monier-Williams)，中国多采用氮滴定蒸馏法和离子色谱法，日本多采用盐酸副玫瑰胺比色法[6]。但这些方法存在耗时长、检测成本高等缺陷。一些快检方法相继出现，包括电化学法[7]、色度比色法[8]、近红外荧光探针法[9]，虽在检测耗时上有极大的改善，但灵敏度低，对样品破坏程度大，实际使用效果不佳。近年来，为探究更加便捷，有效的检测方法，将近红外光谱技术运用于面粉非法添加的检测[10]及鱼糜品质评价[11]等领域且取得了良好的效果，其快速、无损的检测优势也受到广泛的认可。因此，本试验拟采用该技术建立食品中亚硫酸盐残留量的检测方法，旨在为市售银耳的食用安全检测和预防工作提供一定的参考和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

银耳：盛耳牌，购于上海临港古棕路农工商超市；

药用硫磺：食品级，国药集团化学试剂有限公司；

盐酸、碘滴定液：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

KBr：光谱级，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：ME104E型，瑞士梅特勒-托利多公司；

高速粉碎仪：CT410型，丹麦福斯公司；

红外光谱仪及单点ATR附件：Nicolet iS5型，美国赛默飞世尔公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 将100 g银耳置入熏染室，取3 g硫磺放入石棉瓦上，点燃搪瓷中的酒精用以引燃硫，当硫磺形成明显的蓝色火焰后，放入空白银耳样品进行硫熏处理(图 1)。硫熏后取出并放入真空干燥箱内，45 ℃条件下干燥24 h。干燥后的银耳用高速粉碎仪粉碎并过120目筛，将原始硫熏银耳标记为A-1。将原始硫熏银耳和银耳空白样本按一定比例配制成不同亚硫酸盐含量的银耳样本，将原始硫熏银耳与银耳空白按质量比5∶1混合，记作5/1(A-2)，其他各组依次标记为2/1 (A-3)、1/1 (A-4)、1/2 (A-5)和1/5 (A-6)。

1. 熏蒸室 2. 银耳样品 3. 镂空隔板 4. 酒精灯 5. 硫磺

1.2.2 精确检测银耳中亚硫酸盐含量的方法 参考GB/T 5009.34—2003《食品中亚硫酸盐的检测》中的碘滴定法。准确称取5 g银耳样品置于装有250 mL超纯水和沸石的圆底蒸馏烧瓶中，再加入10 mL盐酸(6 mol/L)，加热至微沸并保持3 min后，通过碘标液(0.01 mol/L)滴定游离的二氧化硫至产生蓝色且20 s内不褪色。通过碘溶液的消耗量折算出二氧化硫的含量，其中1 mL碘标液相当于0.640 6 mg二氧化硫。

1.2.3 红外光谱的采集 取样品1 mg与 溴化钾100 mg混合并进行压片制样，红外单点ATR的参数设置为扫描范围550～4 000 cm-1；分辨率4 cm-1；16次平行。经傅里叶红外光谱仪获取原始谱图，再经基线校准和谱图校准得到傅里叶红外光谱。为降低信噪比、提高谱图表观分辨率，傅里叶红外光谱经7点Savitsky-Golay平滑和二阶导数，获得二阶导数红外谱图。将银耳样品放入样品池，以外界温度的改变为微扰，温度范围30～70 ℃，升温速率2 ℃/min，不同温度的动态原始谱图每5 ℃采集1次，并使用SpectraCorr软件处理后，获取二维红外光谱图。

1.2.4 定量模型的构建 银耳样本以校正集∶验证集为3∶1的比例被随机选取。通过比较3种化学计量学(CLS、SMLR 和PLS)的建模效果，选取最佳化学计量法。并采取150组银耳样本在TQ Analyst软件中优化亚硫酸盐的定量检测模型。随后，采取t检验验证3组未知亚硫酸盐含量银耳的模型预测值和其真实值的显著性差异。其中未知亚硫酸盐含量的真实值由碘滴定测得。

2 结果与讨论

2.1 样品的亚硫酸盐含量

采用通氮滴定蒸馏法检测所制备的不同水平亚硫酸盐含量的银耳样本(A-1～A-6)的亚硫酸盐残留量分别为 24.26，20.21，16.22，12.18，8.15，3.96 mg/g，不同样品在表观上存在显著差异，随着亚硫酸残留量的增加，银耳样品越发显白，同时黄色逐渐变浅(图 2)。

图2 不同混合梯度下制备的亚硫酸盐不同含量的银耳样品

2.2 三级红外光谱分析

2.2.1 FT-IR分析 由图3可知，3 346 cm-1处的吸收峰(vas，N—H)主要由糖类和蛋白质引起，2 925，2 854 cm-1的吸收峰(v，CH2)和1 737 cm-1的吸收峰(vs，C═O)归属于脂质，且1 043 cm-1处的吸收峰(δ，C—O)来源于纤维素。随着银耳中亚硫酸盐含量增加，属于纤维素的碳氧单键伸缩振动峰强逐渐减少，因此1 043 cm-1吸收峰的峰强可用来鉴定银耳是否被硫磺熏染。

2.2.2 SD-IR分析 红外二阶导数谱能有效区分傅里叶红外光谱的重叠峰，从而增强谱图的表观分辨率和扩大红外谱图的细微差异[12]。为此，采用红外二阶导数谱进一步分析不同水平残留银耳的谱图差异。随着银耳中亚硫酸盐含量的增加，983 cm-1处吸收峰的蜂强显著增强，见图3。尤其是，根据亚硫酸盐的标准红外谱图(图4)可知，983 cm-1处吸收峰归属于亚硫酸基团的反对称伸缩振动。二阶导数红外光谱验证了硫磺通过燃烧反应变成亚硫酸盐并附着于银耳上。然而，二阶红外导数光谱无法清晰揭示硫磺熏染漂白银耳的机制。

图3 空白银耳和不同亚硫酸盐含量银耳的傅里叶红外谱图和二阶导数谱图

Figure 3 FT-IR spectra and SD-IR spectra oftremellablank andtremellawith various contents of sulfite

图4 亚硫酸盐和维生素B2的标准红外光谱图

2.2.3 2DCOS-IR分析 为了进一步分析二氧化硫在银耳中所发生的化学反应，采用二维相关红外光谱(2DCOS-IR)对硫磺熏染前后的银耳进行分析。二维相关红外光谱能扩大谱图分辨率且提供更多由于外界微扰而引起的分子变化信息，从而定性和定量区分物质[13]。以银耳中不同亚硫酸含量为外界微扰构建二维相关谱图，对角线上自动峰显示对特征吸收峰的相关性和灵敏度。

在960～1 000 cm-1波段的银耳二维红外光谱中存在一个较强的自动峰，该峰为963 cm-1处多糖的碳氧双键变形振动(δ，C═O)产生。然而，亚硫酸盐的二维红外光谱在983 cm-1处有较强的自动峰，该峰归属于硫氧单键的非对称伸缩振动vas(S—O)，见图 5。随着银耳中亚硫酸盐含量的增加，963 cm-1处的自动峰强度逐渐降低，但983 cm-1处的自动峰强度增强。此外，随着银耳中亚硫酸盐含量的增强，自动峰963，983 cm-1的交叉峰呈现正相关，显示2个自动峰的变化趋势相同。但983 cm-1处的自动峰的增强并未影响963 cm-1处的自动峰的减弱。因此硫磺熏染银耳并未破坏银耳内部的多糖成分。

维生素B2在4 000～3 000 cm-1区域的二维红外光谱中存在一个最强的自动峰为3 506 cm-1，其归属于羟基自由基的振动。而且，该自动峰也是硫熏银耳的二维相关红外谱中较强吸收峰(图6和表1)。表明银耳中含有维生素B2。随着银耳中亚硫酸盐含量的增加，3 506 cm-1处的自动峰峰强逐渐减弱，而且维生素B2呈现黄色。表明维生素B2中羟基自由基在硫熏过程中被破坏。维生素B2的氧化和其他色素的破坏共同导致了银耳的漂白，其中维生素B2中羟基自由基的破坏在硫熏漂白过程中起到重要作用。

2.3 定量建模

由于红外谱图数据的复杂性，谱图的有效信息需要经过化学计量学提取出来。因此，红外定量模型常需要依靠化学计量学包括经典最小二乘的模式识别方法(CLS)，逐步多元回归(SMLR)和偏最小二乘法(PLS)来构建。本研究分别采用3种化学计量学方法来构建银耳中亚硫酸盐含量的定量模型，并通过比较3种定量模型的拟合程度来优化出最适化学计量学方法。其中，模型的R和RESECV值用来评估拟合情况和准确度。基于上述6组硫熏银耳和空白银耳样品建立3种化学计量学模型的拟合效果见表2。结果表明，基于PLS建模的拟合效果最优。

图5 1 000～960 cm-1波段范围内银耳标样、亚硫酸盐以及不同亚硫酸盐含量银耳样品的二维同步相关光谱图

图6 4 000～3 000 cm-1波段范围内银耳标样、维生素B2以及熏染不同质量硫黄的银耳样品的二维同步相关光谱图

采取150个不同硫熏银耳来优化基于PLS的定量模型，其拟合效果R为0.980 4，RMSECV为0.97(图7)。通过采取3组硫熏银耳(13.75，21.50，33.84 mg/kg)来交叉验证模型的准确性和应用性。通过碘滴法来获取其真实值，验证组银耳的亚硫酸盐含量，再和红外定量模型给出的预测值进行t检验(表3)。结果表明，模型结果不存在显著性差异，能用于快速定量检测银耳中亚硫酸盐的含量。

表1 维生素B2的红外光谱主要特征吸收峰

图7 基于FT-IR光谱定量测定亚硫酸盐含量的PLS定量模型

不同模型R值RMSECV值CLS0.92661.53SMLR0.94392.11PLS0.96881.03

表3 银耳中亚硫酸盐含量的定量模型的精度检验

3 结论

本研究基于红外光谱揭示了硫熏银耳漂白的机理，并构建了快速定量检测银耳中亚硫酸残留量的模型。结果表明，随着硫熏银耳的亚硫酸盐含量增加，傅里叶红外光谱中1 043 cm-1处峰强逐渐减少，表明可通过该吸收峰强度判断银耳是否被硫熏。二阶导数红外光谱验证了硫磺通过燃烧反应后最终形成亚硫酸盐并附着于银耳上。二维相关红外光谱进一步揭示，硫熏破坏了银耳中维生素B2中羟基自由基，从而实现硫熏漂白银耳的目的。采用3种化学计量法(CLS、SMLR和PLS)比较建模发现，基于PLS的红外定量模型具有良好的拟合效果(R为0.980 4；RMSECV为0.97)。t检验表明，定量模型具有良好的准确性和适用性。该方法能用于快速、定量检测食品中亚硫酸盐的残留量，为近年来多发的食品安全问题的检测和预防工作提供一定的参考和指导。

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Rapid and quantitative determination of sulfite residue intremellabased on IR spectroscopy and PLS

YUAN Kai WANG Xi-chang ZHANG Long GU Dong-chen GUO Xiao-xi FAN Zhen-yu

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The change regulation of the content chemical functional group intremellasamples with different setting levels of sulfite content was explored by using the infrared spectroscopy, and the mechanism of bleaching was further revealed. A rapid quantitative method testing the sulfite residue intremellawould be established. Moreover, the true content of sulfite content was detected by biodine drop method. The infrared spectra of the samples with different levels of residual sulfur were collected and analyzed, and the quantitative detection model based on partial least squares(PLS)was builded. The result indicated that the sulphur fumigation bleachingtremellathrough destroying the hydroxyl radicals of vitamin B2. Moreover, IR quantitative prediction model for sulfite residue intremellabased on PLS has been established withRof 0.980 4 and RMSECV of 0.97. This approach showed well potential to provide a rapid, nondestructive and quantitative method for detecting the sulfites residue in food.

sulfite residue;tremella; a rapid quantitative method; IR spectroscopy; chemometric methods

上海海洋大学与大山合集团有限公司的横向研究项目(编号：D-8006-14-0075)

袁凯，男，上海海洋大学在读硕士研究生。

王锡昌(1964—)，男，上海海洋大学教授，博士。 E-mail：xcwang@shou.edu.cn

2017—03—10

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.013