茶色素对年轻恒牙牙合面窝沟封堵的对比观察研究

姚 军， 谢 莉， 陈胜兰， 张佳丽， 叶心仪， 卢兆杰

茶色素对年轻恒牙牙合面窝沟封堵的对比观察研究

姚 军1， 谢 莉2， 陈胜兰2， 张佳丽1， 叶心仪2， 卢兆杰3

目的 探讨应用茶叶有效成分封堵年轻恒牙牙合面的窝沟以预防窝沟龋的可行性。 方法 将36颗离体牙随机分为6组(n=6)：24 mg/mL的绿茶、白茶、乌龙茶、红茶溶液组以及1 mg/mL茶色素成品组和窝沟封闭组。除窝沟封闭组，其余5组均将离体牙牙冠分别倒置在上述茶浸出液中，浸泡24 h后，使用立体显微镜和扫描电子显微镜观察各组牙齿表面特别是牙合面窝沟处的茶色素吸附情况。 结果 立体显微镜下观察：茶色素组相对于其他种类茶叶组的窝沟处色泽较深，其次为红茶组、乌龙茶组、白茶组以及绿茶组。扫描电子显微镜下观察：除绿茶组外，其他实验组窝沟处都有吸附物封堵，各组吸附物厚度经方差分析显示,差别有统计学意义(P<0.05)；用LSD检验进行各组间两两比较，显示各组间差别具有统计学意义(P<0.05)。 结论 牙合面点隙窝沟处的物质与茶色素有关，可以以茶色素为主要研究对象，进一步研究应用茶叶进行物理性封堵窝沟来预防龋病的可行性。

茶叶； 色素类； 龋齿； 窝沟封闭物； 吸附； 显微镜检查，电子，扫描

龋损好发于牙体咬合面，发生于窝沟点隙的龋病称为窝沟龋，具有较大的破坏性[1]。在我国，儿童龋病的发生率约为50%，其中约80%为窝沟龋[2]。目前，国际上公认最有效的窝沟龋预防方法是窝沟封闭术[3-8]。该封闭术在临床上运用几十年，已较为成熟，效果也获得肯定。但是，窝沟封闭术的操作必须在口腔治疗椅上进行，且操作步骤复杂，使其普及率不高。寻找一种操作简单、对硬件和孩子的配合程度均要求不高、并能有效封堵年轻恒牙窝沟的龋病预防方法是必要的。

茶的成分丰富，含有茶多酚、茶色素(tea pigment,TP)、咖啡碱、氨基酸、生物碱及维生素等对人体有益的成分[9]。根据陈绍宽的研究，茶的制造方法可以分为不发酵、轻发酵、重发酵以及全发酵4类[10]。随着发酵程度的增加，TP的含量也不断增加。不发酵类的绿茶，其主要活性成分为茶多酚，而对于全发酵类的红茶，主要活性成分为TP，它是唯一有明显颜色的物质。TP是从茶叶中提取的一类小分子酚性氧化聚合物，是一种具有极高生物活性的药用物质，可以从红茶中直接提取，也可由茶多酚直接氧化获得[11-12]。TP中的茶黄素易吸附于牙面，其对唾液富组蛋白5最具亲和力,可导致较严重的牙着色，且能快速沉积到全唾液生物膜表面,并很难去除[13-14]。本实验针对TP易吸附的特点，使用立体显微镜以及扫描电子显微镜观察不同茶类的茶叶浸出液在牙齿窝沟处的吸附情况，探讨TP对窝沟封堵的可能作用。

1 对象与方法

1.1 对象 标本来自临床提供的36颗因正畸治疗被拔除的上颌前磨牙，男性18例，女性18例，年龄中位数14岁(12～16岁)。纳入标准：因正畸治疗拔除的前磨牙，深窝沟，无龋坏，无明显磨耗和裂痕。排除标准：非因正畸治疗拔除的前磨牙，龋坏，有明显磨耗和裂痕以及在实验切割中损坏的标本。

1.2 材料和仪器 绿茶(发酵程度0%,浙江采云间茶叶有限公司)；白茶(发酵程度10%，福鼎市天健茶叶有限公司)；乌龙茶(发酵程度50%，福建日丰生态茶叶有限公司)；红茶(发酵程度100%，武夷山正山茶叶有限公司)；TP(茶黄素含量40%，浙江大学农学院茶学系提供)。电子分析天平(BSA224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；超声清洗仪(KQ-100TDV，昆山超声仪器有限公司)；慢速锯(IsoMet1000，美国标乐公司)；新型真空磁控离子溅射镀膜仪(Q150R，英国Quorum公司)；场发射扫描电子显微镜(Quanta 450 FEG，美国FEI公司)；数显电热恒温干燥箱(202.2A型，上海阳光实验仪器有限公司)；双目立体显微镜(PXS5-B，上海测维光电技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 茶叶浸出液及TP组的制备 无菌条件下，将绿茶、白茶、乌龙茶及红茶各称取2.4 g浸泡于100 mL沸腾的蒸馏水中，时间为20 min，滤纸过滤，得24 mg/mL的各茶类茶叶浸出液。在无菌的条件下，用天平精确称取TP 10 mg与10 mL蒸馏水混匀，配制成1 mg/mL的TP溶液。

1.3.2 分组 将超声波清洗过的36颗离体牙牙冠朝下倒置，随机分到24 mg/mL的绿茶组、白茶组、乌龙茶组和红茶组以及1 mg/mL TP中浸泡24 h，窝沟封闭组则采用常规的窝沟封闭术。共6组，每组6颗离体牙。

1.3.3 立体显微镜下观察 将以上6组茶叶浸出液浸泡后的标本用去离子水超声洗涤，干燥后在立体显微镜下观察牙合面窝沟TP的吸附情况。

1.3.4 扫描电子显微镜下观察 各组随机抽取3个标本进行扫描电子显微镜观察。采用慢速锯将茶叶浸泡后的标本牙根去除后，再将牙冠按照与窝沟垂直的方向纵向切割成2 mm厚的横截片，每个标本取3个不同部位的横截片，共18个。用去离子水超声洗涤，干燥、喷金后扫描电子显微镜下观察。

2 结 果

2.1 立体显微镜下观察结果 在24 mg/mL相同浓度下，除了绿茶组牙面无明显TP吸附外，其他组牙面均能见到TP附着现象，且主要附着在牙面的点隙窝沟处,其中红茶组吸附最明显，其次为乌龙茶组和白茶组(图1)。

A：24 mg/mL绿茶组，窝沟处未发现明显色素附着； B：24 mg/mL白茶组，窝沟处及其周围可见较浅的色素附着； C：24 mg/mL乌龙茶组，窝沟处及其周围可见较深的色素附着； D：24 mg/mL红茶组，窝沟处及其周围可见面积较大且较深的色素附着； E：1 mg/mL茶色素组，在牙齿光滑面及窝沟处均可见较深的色素附着； F：窝沟封闭组，在窝沟处可见质地均匀白色不透明的窝沟封闭剂.图1 立体显微镜下观察各组标本的窝沟茶色素吸附情况( ×10)Fig 1 Stereo microscope on the grooved chewing pigment adsorption of each specimen( ×10)

2.2 窝沟形态的扫描电子显微镜分析 浓度为24 mg/mL的各茶类中，除绿茶组外，其他各组窝沟处都有吸附物封堵窝沟。色素附着厚度(μm)：白茶组(191.72±12.06)，乌龙茶组(368.52±17.90)，红茶组(669.42±33.92)，TP组(894.37±28.73)，窝沟封闭组(1 016.58±64.76)。各组数据经方差分析显示，差别均有统计学意义(F=540.719,P<0.05)。进一步使用LSD检验进行各组间两两比较显示，各组间差别均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 扫描电子显微镜下观察结果 100倍视野下：各组标本均可见牙釉质与牙本质间有明显界限，窝沟处于牙釉质区，形态细长，深度接近牙本质界。绿茶组的窝沟内未见明显吸附物；白茶组可见窝沟底部有少量吸附物；乌龙茶组可见窝沟开口处有吸附物封堵；红茶组可见窝沟开口处有吸附物；TP组可见整个窝沟均有吸附物；后4组的吸附物质与窝沟表面连接较为松散；窝沟封闭组可见窝沟封闭材料几乎充满整个窝沟且与窝沟表面紧密连接(图2)。1 000倍视野下：绿茶组的窝沟内虽未见明显吸附物，但在窝沟表面有极少量的吸附物；白茶组和乌龙茶组可见吸附物成团块状，吸附物可见裂纹且与窝沟表面的连接不够紧密；而红茶组吸附物未见裂纹，未能有效封堵整个窝沟；TP组中可见窝沟充满吸附物，但吸附物有裂纹；窝沟封闭组可见窝沟封闭材料质地致密，充满整个窝沟且与窝沟表面紧密连接(图2)。

1：牙釉质； 2：牙本质. A～F：100倍； A1～F1：1 000倍. A,A1：24 mg/mL绿茶组：窝沟处未见附着物；B,B1：24 mg/mL白茶组，窝沟底部见少量松散的附着物；C,C1：24 mg/mL乌龙茶组，窝沟开口处见少量松散的附着物；D,D1：24 mg/mL红茶组，窝沟开口处见大量附着物；E,E1：1 mg/mL茶色素组，整个窝沟处充满附着物且附着物内有微小裂纹；F,F1：窝沟封闭术组，整个窝沟处充满质地均匀且接合紧密的窝沟封闭剂.图2 扫描电子显微镜放大100或1 000倍下观察各组茶色素吸附情况Fig 2 Observed under SEM magnified 100 or 1 000 times each nest ditch pigment adsorption condition

3 讨 论

由于年轻恒牙龋病多发，且主要发生在牙齿的窝沟处。若不能采取积极有效的措施加以预防和治疗，将可能进一步发展成为牙髓炎、根尖周炎甚至牙齿缺失，严重影响儿童的身心健康[15-17]。因此，预防年轻恒牙龋病成为关注的焦点。目前，防治龋病的主要方法中，以窝沟封闭术最为有效，但因其技术要求较高，较难普及。本研究从长期饮茶导致牙面色素附着且色素不易清除这一现象得到启发，猜想是否可将茶叶中的相关成分应用于牙合面点隙窝沟处，从而实现预防窝沟龋的目的。作为TP含量最高的红茶，在我国资源丰富。近年来研究表明，茶叶中所含的茶多酚、TP及其衍生物能够抑制多种口腔致病菌[18-19]，其中绿茶所含的主要活性成分茶多酚可减少龋病的发生[20]，而红茶中的主要成分TP不仅对葡萄糖基转移酶催化的胞外多糖-葡聚糖的合成有明显的抑制作用，而且能够有效地降低淀粉酶的活性，从而起到比茶多酚更好的抑菌效果[21-23]。

本实验将离体牙牙冠朝下倒置浸泡于处理液中，从而排除重力作用导致的大分子物质沉积的因素。通过立体显微镜观察不同茶类以及不同浓度的茶叶在窝沟处的吸附情况，可知红茶的吸附情况较同等浓度的其他茶类效果好。由于红茶所含TP的浓度较其他茶类的茶叶高，为进一步探索是否与TP在牙合面的吸附有关，本实验增加了TP组，对比窝沟封闭术、红茶、TP在牙合面窝沟处的封堵情况，结果显示，TP在牙合面的吸附情况较红茶效果好，可在整个窝沟内形成吸附，更好的封堵牙合面窝沟。

虽然在扫描电子显微镜下可见吸附物质与窝沟牙釉质处有微小的裂纹，但是这可能与实验前标本脱水以及扫描电子显微镜下高能入射电子束轰击扫描标本表面，造成TP吸附物质与牙釉质的裂纹有关。在实验切割、冲洗牙体标本的过程中，其窝沟处TP吸附物并未脱落，足以证明TP在窝沟处吸附牢固。虽然通过实验对比，可知在牙合面的TP吸附不如传统窝沟封闭术紧密，但其可作为传统窝沟封闭术的补充，同时发挥预防龋病的作用。

本实验作为一种初期探讨，虽然观察到TP有封堵窝沟的作用，但离实际应用还有距离。例如以下几个问题：TP在牙面窝沟处吸附不够致密，与牙面连接不够紧密；TP在牙合面的吸附产生的棕黑色与龋坏导致的棕黑色相似，易被误认为是龋坏，如何改变其颜色也是需要考虑的问题;如何使TP在短时间内达到牢固有效的吸附；由于TP纯品具有强的口腔收敛作用，在口腔内易产生苦涩感，如何去除也是研究的重点所在。

[1] 冯希平. 我国龋病流行趋势及对策[J].中华口腔医学杂志, 2009,44(2):69-71.

[2] 杨 是, 石四箴. 口腔预防医学及儿童口腔医学[M]. 2版. 北京:人民卫生出版社, 1997:253-254.

[3] 马 宏, 李玉晶. 恒磨牙窝沟龋釉质表面结构扫描电镜观察[J]. 北京口腔医学, 2009,17(1):31-33.

[4] 储冰峰, 刘洪臣, 周继林. 光固化窝沟封闭剂五年临床效果[J]. 中华口腔医学杂志, 1999,34(2):115-117.

[5] 吴幸晨, 束陈斌. 窝沟封闭术在儿童口腔临床中的应用和防龋效能[J]. 国际口腔医学杂志, 2013,40(4):467-470.

[6] 乔 静. 窝沟封闭术预防窝沟龋齿的临床疗效[J]. 求医问药学术, 2012,10(9):25.

[7] 简继忠, 周灿禄. 光固化窝沟封闭术在儿童第一磨牙防龋中的效果[J]. 广东医学, 2012,25(12):143-144.

[8] 刘 燕. 窝沟封闭预防六龄齿龋齿的效果观察[J]. 中国妇幼保健, 2011,8(14):198-199.

[9] 冯彬彬. 茶叶提取物的药用价值及开发利用[D]. 重庆：西南大学, 2007.

[10] 陈绍宽. 鉴茶、泡茶、品茶全书[M]. 北京:化学工业出版社, 2010:47-52.

[11] 吕 虎, 华 萍, 余继红, 等.茶色素药理作用研究进展[J]. 中国新药与临床杂志, 2005,3(9):745-749.

[12] 宛晓春, 李太样, 夏 涛. 茶色素及其药理学功能[J]. 天然产物研究与开发, 2001,13(4):65-69.

[13] 林 锋, 姚江武. 外源性色素吸附于人唾液蛋白质膜表面的动力学观察[J]. 中华口腔医学杂志, 2013,48(增刊1):125-128.

[14] Yao J W, Lin F, Tao T,etal. Affinity interactions between natural pigments and human whole saliva[J].ArchivesofOralBiology, 2011,56(3):285-293.

[15] 何 燕. 局部涂布氟化物防龋[J]. 中国保健营养, 2013,9:131.

[16] 樊明文, 边 专. 防龋疫苗主动免疫的现状与未来[J]. 中华口腔医学杂志, 2002,37(6):401-404.

[17] 樊明文. 关于免疫防龋[J]. 中华口腔医学杂志, 2006,14(5):279-282.

[18] 王 萍, 罗慧琼, 张福军, 等. 复方茶多酚含漱液对正畸儿童牙面菌斑中致龋菌的影响[J]. 中国微生态学杂志, 2010,22(7):623-625.

[19] 曹 进, 傅学志, 刘清海. 茶中儿茶素对变形链球菌生长、产酸、粘附影响的体外实验[J]. 中华口腔医学杂志, 1991,26(3):161-163.

[20] Ooshima T, Minami T, Matsumoto M,etal. Comparison of the cariostatic effects between regimens to administer oolong tea polyphenols in SPF rats[J].CariesRes, 1998,32:75.

[21] Yu H, Xu L X, Oho T,etal. The effect of a tannin-fluoride mixture on human dental enamel[J].CariesRes, 1993,27:161.

[22] Hattori M, Kusumoto I T, Namba T,etal. Effect of tea polyphenols on glucan synthesis by glucosyltransferase for Streptococcus mutans[J].ChemPharmBull, 1990,38(3):717-720.

[23] 田中伸子, 岡村浩. On the factors affecting variation of α-amylase activity in saliva of normal subjects:Ⅱ effects of tannin (polyphenol) in a black tea solution on α-amylase activity in saliva[J].NipponKaseiGakkaishi, 1989,40(7):587-592.

(编辑：何佳凤)

The Study of Tea Pigments to Seal Fissure of Young Permanent Teeth

YAO Jun1, XIE Li2, CHEN Shenglan2, ZHANG Jiali1, YE Xinyi2, LU Zhaojie3

1. Department of Pedodontology, Fujian Medical University School of Stomatology, Fuzhou 350002, China；2. Fujian Medical University School of Stomatology, Fuzhou 350122, China；3. Department of Special Dentistry, Fujian Medical University School of Stomatology, Fuzhou 350002, China

Objective To investigate the active role of different components in tea in caries prevention. Methods 36 isolated teeth were randomly assigned to 6 groups. Each group had 6 teeth: 24 mg/mL green tea group, 24 mg/mL white tea group, 24 mg/mL oolong tea group, 24 mg/mL black tea group, 1 mg/mL tea pigment group, and dental sealant group. The isolated teeth were immersed in the assigned liquid for 24 h. Using stereo microscope and scanning election microscope(SEM) we evaluated the pigmentation on the tooth surface. Results Tea pigments group showed better in the sealing than the other tea groups, but no more than dental sealant group. The green tea had no adsorption at the fissure by SEM observing. Among the different groups the result was statistically significant(F=540.719,P<0.05). With LSD test comparison between two groups each time, it was shown that there was statistical difference between groups(P<0.05). The high concentration of black tea group showed better sealing result. Conclusions The effect of high concentration of black tea is the best. Substance observed at the fissure is related to tea pigment, therefore we think that tea pigments can be of field of interest for the prevention of dental caries.

folium camelliae; pigments; dental caries; pit and fissure sealants; adsorption; microscopy, electron, scanning

2016-09-21

福建省卫生厅中青年骨干人才培养项目(2013-ZQN-ZD-22)

福建医科大学 1.附属口腔医院 儿童牙科，福州 350002；2.口腔医学院，福州 350122；3.附属口腔医院特诊科，福州 350002

姚 军，男，主任医师，齿学博士. Email: dentyao@163.com

R282.71； R348.6； R780.1； R781.1； R977.7

A

1672-4194(2017)02-0121-05