鸡精液DMA颗粒冷冻与解冻方法研究

伍应松，李 鹏,，孙 鏖，燕海峰，秦世新

（1.湖南省娄底市畜牧水产局，湖南 娄底 417600；2.湖南省畜牧兽医研究所,湖南 长沙 410131；3.湘西自治州畜牧工作站，湖南 吉首 416000）

鸡精液DMA颗粒冷冻与解冻方法研究

伍应松1，李 鹏1,2，孙 鏖2，燕海峰2，秦世新3

（1.湖南省娄底市畜牧水产局，湖南 娄底 417600；2.湖南省畜牧兽医研究所,湖南 长沙 410131；3.湘西自治州畜牧工作站，湖南 吉首 416000）

鸡精液 DMA 颗粒冷冻技术方法简单，但还很不稳定。试验采用 3 种颗粒冻精制作以及 2 种冻精解冻技术对黑丝羽乌骨鸡精液冷冻技术进行了研究。结果表明：1）非浮体方式当温度设定为 -40 至 -170℃的较宽范围时，温度对活力影响较大，滴冻起始温度与持续熏蒸时间二者交互作用下，对活力影响差异显著 (P＜0.05)；浮体方式当温度范围为-100℃至 -130℃，时间对活力影响较大，滴冻起始温度与持续熏蒸时间二者交互作用下，对活力影响差异不显著(P＞ 0.05)。2）采用颗粒直接滴冻技术，稀释后平衡 10min 与平衡 20min 组冻精解冻后活力没有显著差异；解冻温度为40℃和 50℃较好，两组之间活力无显著差异；采用恒温板解冻，每次解冻 1 颗的活力显著高于每次解冻 3 颗的活力。因此，黑丝羽乌骨鸡精液，采用 DMA 为冷冻保护剂，稀释后平衡 10min，添加冷冻保护剂后直接滴冻，50℃恒温板解冻能获得较好的冷冻效果。

黑丝乌骨鸡；DMA；颗粒冻精

鸡精液冷冻技术，可以有效地保护许多濒临灭绝的地方品种，保持遗传资源的多样性，可作为活体保种辅助形式，降低保种成本；能将疾病和自然灾害造成的损失减至最低程度，可减少活体引种带来的疫病传播。

精液冷冻技术的关键因素包括剂型、冷冻保护剂、冷冻与解冻速率等。鸡精液冷冻剂型有细管和颗粒两种，细管冻精使用方便，可减少微生物污染。颗粒冻精在储存过程与解冻操作中表面脱落严重，易污染，不便标记等。但有研究报道，鸡颗粒冻精的受精率比细管要高。

冷冻保护剂对精液有毒害作用，DMA毒害作用最小（张志平等 2010），利用 DMA 作为鸡精液冷冻保护剂，解冻后可以不通过离心将其去掉就可直接输精，方法相对简单。

目前，鸡精液冷冻技术，还存在受精率低，效果不稳定等困境，而各种冷冻（熏蒸法、直接滴冻法等）、解冻（直接水浴法、仪器法等）方法均缺乏规范性与稳定性，阻碍了鸡精液冷冻技术的发展。本文对鸡精液DMA颗粒冷冻技术中冷冻与解冻速率进行研究，为建立高效稳定的冷冻解冻技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

黑丝羽乌骨鸡公鸡 50羽，两种鸡精液稀释液（B 与 F），超低温数字温度计，pH 计、全自动冰点渗透压计、视频恒温显微镜系统、恒温水浴锅、颗粒冻精制作装置颗粒冻精解冻恒温板等均由湖南省畜牧兽医研究所提供（黄琳等 2017）。

1.2 方法

1.2.1 精液采集与质量检测

利用 2mL离心管，采集单只公鸡精液，放入10℃左右冷藏箱保存，30min 之内带回实验室。打开视屏恒温显微镜，将温度恒定到 32℃，预热载玻片。取 20μL原精或稀释后的精液到载玻片上，盖上盖玻片。保留活率在 0.6 以上、密度在中等以上（20 亿 /mL）的精液用于以下试验。

1.2.2 铜网滴冻与水浴解冻

在 10℃左右利用 YHFB 液对精液进行 1：1 等温稀释，摇匀后再次在显微镜下检测活力，淘汰活力差的精液。将合格精液混合，装入 10mL 冷冻管中（每 5 只公鸡为一组，每组约 6mL），以下步骤混匀后在 4℃进行。静置 10min,加入事先在此温度预冷的 DMA冷冻保护剂，使 DMA最终浓度为 6%，静置 5min。分别采用以下 2 种方式进行滴冻：

（1）铜网固定滴冻方式。选择合适大小的液氮容器，倒入适量液氮，在容器上方放置铜网。通过设置铜网与液氮面不同距离获得不同起始温度，测量并记下铜网温度达到相对稳定时的数字，作为滴冻起始温度。将平衡后的混合精液从冰箱中取 出 ， 选 择 不 同 的 起 始 温 度 （-40～-50℃ ，-60～-70℃ ，-100～-110℃ ，-120～-130℃ ，-140～-150℃，-160～-170℃），用滴管吸取混合精液，贴近铜网，挤出一滴（约 0.05mL）于铜网上。滴冻后设置不同的熏蒸时间（1～9min），在用镊子拨动颗粒并夹入含液氮的金属筒中备用。每个筛选条件按以上方法制作3颗冻精。

（2）铜网漂浮滴冻方式。将铜网固定在中空的泡沫上，泡沫浮在液氮中，通过调整铜网与泡沫之间的距离，获得不同滴冻起始温度（-100～-130℃），持续熏蒸过程中，铜网与液氮距离固定，按以上方法制作颗粒冻精并进行 1～9min 冷冻时间选择。

以上两种方式均采用恒温水浴方式解冻。用预冷镊子将颗粒冻精收入2mL细胞冷冻管中（每管1 颗），放入 40℃的水浴锅内缓缓摇晃 1min 后取出，检测活力并记录相关数据。

1.2.3 直接滴冻与恒温漏斗解冻

操作均在 -6℃左右的温度下进行。利用预冷FEB 液对精液进行 1:1 等温稀释，摇匀后再次在显微镜下检测活力，淘汰活力差的精液。将合格精液混合，分装入 2 只 5mL 的冷冻管中，分别置 10min和 20min，加入事先在此温度预冷的 DMA 冷冻保护剂，使 DMA 最终浓度为 6%，混匀后静置 1min。利用滴管对加入保护剂并平衡 1min 后的精液以每滴 0.05mL，将精液直接滴入液氮，数分钟后做解冻处理,每个筛选条件制作 3 颗冻精。

利用恒温漏斗，将解冻温度分别设为 40℃、50℃、60℃、70℃，用镊子将颗粒冻精解冻，直接放入恒温漏斗中，分为每次1颗和每次 3颗解冻，每解冻一次要用玻璃棒将漏斗周围的水进行搅动。

1.2.4 数据处理

数据经 Excel软件处理后，采用 SPSS 20.0 统计软件进行单因素方差分析与显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同批次实验公鸡精液质量稳定性

试验所有批次精液之间，稀释前后并无显著差异，保证了不同批次试验，精液质量的一致性，从而可实现不同批次、日期试验间的可比性。但是，同一批次精液，稀释前后活力差异显著，一方面说明鸡精子密度太大，稀释有利于精子运动；另一方面说明稀释液中营养物质有利于精子运动。

表1 不同批次实验公鸡精液质量平均活力（n=58）

2.2 铜网滴冻试验

由表 2 可以看出，整体而言，非浮体方式在高温段（-40～-50℃）与低温段（-160～-170℃）获得了相对较高的活力；浮体方式在 -100～-110℃之间效果较好；滴冻时间在 1min～9min，没有显著差异。

鸡颗粒冻精不同滴冻起始温度、滴冻后持续熏蒸时间，与颗粒冻精解冻后活力间均存在直接相关性。

表2 鸡颗粒冻精不同方式与冷冻速率解冻后活力记录表（n=156）

为了筛选最佳温度，非浮体方式设定了-40～-170℃的较宽范围，在高、中 与 低温段（-40～-50℃、-120～-130℃、-160～-170℃） 获得了相对较高的活力。以温度作为主效应，其对活力影响差异显著(P＜0.05)，以时间作为主效应，其对活力影响差异不显著(P＞0.05)，这说明在非浮体方式中，温度对活力影响较大；两者交互作用下，对活力影响差异显著(P＜0.05)。

为规避固定铜网方式中因液氮挥发导致的液氮面下降，采用了铜网漂浮在液氮面的方式，铜网离液氮面的距离不随时间的改变而变化。根据前面的试验结果，选择的温度范围缩小为-100～-130℃。以温度作为主效应，其对活力影响差异不显著(P＞0.05)，以时间作为主效应，其对活力影响差异显著(P＜0.05)，这说明在浮体方式中，时间对活力影响较大；两者交互作用下，对活力影响差异不显著(P＞0.05)。

2.3 直接滴冻实验

由表 3 可以看出，稀释后平衡 10min 与平衡20min 组冻精解冻后活力没有显著差异。

表3 稀释后平衡时间优化

解冻温度为 40℃和 50℃两个实验组之间活力无显著差异，显著高于 60℃、70℃的两个组活力。每次解冻1颗的活力显著高于每次解冻3颗的活力。还发现，每次解冻 1 颗，解冻后的精液从漏斗内流下时需要较长时间，而每次解冻3颗则流下时间较短。

表4 解冻条件优化

2 讨论

采用直接滴入液氮法与熏蒸制作冻精，前者操作简单，受操作环境与操作过程影响小，易于规范化。后者，则受倒入液氮、网筛温度平衡时间等诸多因素影响，相对难标准化，但可以实现颗粒冻精冷冻速率的调节与筛选。

3.1 颗粒冻精冷冻速率研究

冷冻速率由两个因素决定，一是滴冻起始温度，二是颗粒达到恒定温度前的持续时间。液氮面与铜筛网的距离决定了滴冻的起始温度。冷冻过程中，精子经历了降温，和冻结两个过程。距离较近时温度下降快，当液氮面与铜筛的距离合适时，降温速度适当，精子内部水分有足够时间向外渗出，使细胞内外的化学势达到平衡态，且细胞内形成的冰晶减少而体积小，有利于精子生存。如果距离过低，降温速度过快，细胞内水分没有充分排除，未渗透的水形成大而多的冰晶，对细胞造成较大伤害，其中-15～-25℃ 为 显 著 有 害 区 ，0～-50℃ 为 有 害 区 ，-60～-250℃为基本安全温度。这些损伤包括：1）由于冰晶导致类脂蛋白变性，破坏细胞膜，导致精子超微结构破坏，顶体膜脱落，膜的完整性和流动性损伤；2）氧化压力升高导致的脂质过氧化，DNA碎片和细胞骨架改变；3） 降温复温过程冰晶形成后的机械损伤；4） 细胞外电解质失衡的化学损伤等 （Mescguer等2004，阮国安等 2008，王尚乾等 2015）。本文采用铜网离液氮面不同距离，研究了颗粒冻精不同滴冻温度的影响，有一定规律，但趋势不稳定。

为解决由于液氮的蒸发而引起的熏蒸温度发生变化，本文采用泡沫浮体制作冻精，效果很好。文献报道的熏蒸时间大多都为 10min 或 3～5min，而本文发现 5～9min 熏蒸时间效果较好。

3.2 解冻方式

黄琳等（2017）报道，黑丝羽乌骨鸡精液采用DMA 作为冷冻保护剂及颗粒冷冻技术，在 54.9℃恒温板解冻可以获得较高的受精率，恒温水浴解冻最简单，且可以多颗同时解冻，在没有特殊解冻装置的条件下是首选方案[4]。与此类似，本文发现恒温漏斗法解冻冷冻精液更加客观，但由于实验中所设计的恒温漏斗的管径较长，精液在解冻时经历了较长时间的高温，对精子有较大的损害，所以解冻的最佳温度也低于以上报道。水浴解冻方式解冻，是通过观察冻精的融化量来决定是否停止解冻，主观性较较强，但操作简单。

由于鸡精液冷冻技术涉及多个操作步骤，熟练程度以及每个步骤条件的固定等均影响冻精的效果，尽管每次每个步骤影响较小，但多个步骤影响效果累加，就会导致批次之间的较大差异。本文非浮体方式、浮体方式以及解冻方式的研究，从冻精活力而言，是逐渐提高的，可能熟练程度也是主要原因之一。

4 结论

本文采用3种颗粒冻精制作以及2种冻精解冻技术对黑丝羽乌骨鸡精液冷冻技术进行了研究，表明颗粒冻精滴冻起始温度，以及熏蒸时间均影响冻精效果。综合来看，黑丝羽乌骨鸡精液，采用DMA 为冷冻保护剂，稀释后平衡 10min，添加冷冻保护剂后直接滴冻，采用 50℃恒温板解冻能获得较好的冷冻效果。

[1] 阮国安,郑彦强.不同咖啡因浓度对鸡精液冷冻效果的影响[J].中国家禽，2008,30(8):25-26.

[2] 张志平,张君涛,丁佩佩,等.不同冷冻保护剂对犬精子冻存的影响[J].中国畜牧兽医,2010,37(2):122-124.

[3]Meseguer M,Garrido N,Pellicer A,et al.Role of cholesterol, ealcium,and mitochondrial activity in the suseeptibility for eryodamage after a cycle of freezing[J].Fertil Steril,2004,81(3):588-594.

[4] 王尚乾，王巍.张炜.人类精子冷冻损伤及保护的研究进展[J]. 中华男科学杂志,2013,19(3):262-265.

[5] 黄琳，孙鏖，朱立军,等. 黑丝羽乌骨鸡精液 DMA 颗粒冷冻技术研究[J].中国畜牧兽医,2017,44(2):447-455.

S831.34

A

1006-4907（2017）03-0037-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.03.017

2017-05-04

伍应松（1981～），男，硕士，专业方向为动物营养与饲料科学,Email:283180408@qq.com